自體骨髓干細(xì)胞移植治療脛骨骨折骨不連

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(1.重慶市涪陵中心醫(yī)院骨科，重慶 涪陵 408000；2.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院骨科，重慶 400037)

在臨床上，可能遇到合并有嚴(yán)重皮膚軟組織損傷的開放性脛骨骨折。在這類損傷的患者中，通常選用外固定支架固定脛骨骨折，同時(shí)可能需要反復(fù)多次清創(chuàng)、游離植皮、皮瓣轉(zhuǎn)移等治療以修復(fù)局部軟組織損傷及缺損。當(dāng)骨折固定傷口艱難閉合之后，可能會(huì)遇到脛骨骨折骨不連。此時(shí)，若拆除外固定支架，行切開植骨鋼板內(nèi)固定治療，可能會(huì)因局部軟組織條件差，出現(xiàn)傷口閉合困難、鋼板骨質(zhì)外露、感染等諸多問題。而采用不予任何干預(yù)的保守治療，又可能會(huì)出現(xiàn)骨不連的問題。面對(duì)兩難的困境，目前的治療方法包括局部超聲刺激、電及電磁刺激，也采用局部注射紅骨髓或者促進(jìn)骨折愈合的藥物等治療[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道[2]，這類損傷的患者當(dāng)中，脛骨骨折骨不連的發(fā)生率仍高達(dá)23%。在處理這類損傷中，筆者采用自體骨髓干細(xì)胞移植治療脛骨骨折骨不連患者11例，療效滿意，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本組患者11例，男7例，女4例，年齡17～49歲。致傷原因：車禍傷9例，重物砸傷2例。骨折均為開放性，其中粉碎性骨折4例，復(fù)位后無(wú)明顯骨缺損10例。其中合并皮膚脫套傷6例，合并皮膚軟組織挫裂3例，單純的開放性傷口2例。經(jīng)過1次手術(shù)2例(2例單純的開放性傷口)，經(jīng)過3次手術(shù)5例(合并皮膚脫套傷3例，合并皮膚軟組織挫裂2例)，經(jīng)過4次手術(shù)4例(合并皮膚脫套傷3例，合并皮膚軟組織挫裂1例)。局部行游離植皮9例瘢痕愈合。骨折均為外固定架固定，病程11～27周，平均19周。所有病例無(wú)嚴(yán)重骨折移位和畸形，X線檢查明確骨不連存在，骨折間隙小于5 mm。

1.2 治療方法

經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)、患者及家屬同意，并簽署知情同意書。完善術(shù)前相關(guān)檢查以明確患者脛骨骨不連部位無(wú)活動(dòng)性感染灶，全身無(wú)感染癥狀及跡象，無(wú)血液系統(tǒng)異常病變?；颊咴跊]有骨髓穿刺相關(guān)禁忌證的條件下，在手術(shù)室常規(guī)消毒鋪巾，局麻下行骨髓穿刺抽取約150～200 mL骨髓液(多點(diǎn)同時(shí)采集)，并送檢、分離及培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，同時(shí)分別在穿刺即刻、術(shù)后1周、術(shù)后2周，取患者外周血分離血清以供MSCs的培養(yǎng)擴(kuò)增。培養(yǎng)約3周之后，計(jì)數(shù)MSCs達(dá)到106/mL數(shù)量級(jí)(約5～10 mL)備用，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物。在手術(shù)室X線透視定位下，用14號(hào)骨穿針準(zhǔn)確刺入脛骨骨不連部位，完全注入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮液。注射完畢后局部傷口無(wú)菌敷料加壓包扎。術(shù)后每月復(fù)查患肢正側(cè)位X線片。

2 結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示均表達(dá)MSCs相關(guān)表面標(biāo)志物CD13、CD90，CD13、CD90陽(yáng)性率達(dá)92.31%，而不表達(dá)造血標(biāo)志物CD14、CD45(圖1)。本組11例均獲隨訪，隨訪時(shí)間為4～27個(gè)月，平均13個(gè)月，所有病例均獲得骨折愈合，愈合時(shí)間為4～11個(gè)月，平均7個(gè)月。患肢功能均恢復(fù)正常功能，能負(fù)重行走，未見跛行，隨訪期間未發(fā)生再次骨折。術(shù)后1個(gè)月復(fù)查X線片顯示：7例可見骨折端周圍有骨痂形成、局部毛糙，所有病例骨折處壓痛及叩痛減輕。術(shù)后2個(gè)月復(fù)查X線片顯示：所有病例骨折端周圍可見有骨痂形成，骨折線仍存在，骨折處壓痛及叩痛明顯減輕。術(shù)后3個(gè)月復(fù)查X線片顯示：骨折端大量骨痂形成，骨折線模糊，其中有3例骨折線消失，所有病例患處壓痛及叩痛基本消失(典型病例見圖2)。隨訪中未發(fā)現(xiàn)任何并發(fā)癥，未發(fā)生骨折感染。

a:MSCs表面抗原標(biāo)志物CD90+CD13+為92.31%；b：MSCs表面抗原標(biāo)志物CD90+CD14-為85.63%；c：MSCs表面抗原標(biāo)志物CD13+CD45-為68.01%

圖1流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs表面抗原標(biāo)志物的表達(dá)

3 討論

自體骨髓干細(xì)胞移植治療骨折骨不連是一種新的治療骨不連的辦法[3]，已有很多相關(guān)報(bào)道。其主要是利用了骨髓中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，又可稱為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，存在于成年動(dòng)物或人骨髓中的非造血組織的一種干細(xì)胞。其突出的特點(diǎn)是強(qiáng)大的增殖力、多向分化潛能、可塑性和遷移性，它是一種永生細(xì)胞，在體內(nèi)具有很強(qiáng)的自我更新能力。MSCs是一群具有多向分化潛能的均質(zhì)性細(xì)胞，可向多種非造血組織分化，在特定誘導(dǎo)條件下可分化為多種間充質(zhì)細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞等，并具有自我更新的能力[4]和分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和其他生物活性因子等[5]，最近研究還發(fā)現(xiàn)他還有造血功能[6]。這是其應(yīng)用于臨床治療骨折骨不連的理論基礎(chǔ)。其來(lái)源豐富(患者自身的骨髓)，取材方便(骨髓穿刺即可獲得)，易純化擴(kuò)增，培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，可自體移植而且移植方式比較簡(jiǎn)便，克服了免疫排斥問題[7]，并且不涉及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的相關(guān)問題。然而人體MSCs含量很稀少(尤其是老年人)，直接分離后移植數(shù)量很難得到保證。也有研究認(rèn)為[8]，經(jīng)皮自體骨髓移植是治療脛骨干骨不連的一種有效、安全的方法，但是其療效與移植骨髓中祖細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)系，而且骨髓穿刺所采集到的祖細(xì)胞的數(shù)量似乎小于最理想的濃度,因此體外擴(kuò)增就顯得很重要。然而有相關(guān)研究結(jié)果提示[9]：目前體外培養(yǎng)的環(huán)境不利于MSCs的長(zhǎng)期增殖，長(zhǎng)期培養(yǎng)可能會(huì)減弱其合成膠原的能力，為了最大限度地保存MSCs的各種能力，培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)盡可能短。從本組體外培養(yǎng)擴(kuò)增后移植治療脛骨骨折骨不連的效果來(lái)看，體外培養(yǎng)擴(kuò)增3周并未影響MSCs成骨能力。

a：術(shù)前X線片；b：骨折術(shù)后復(fù)查X線片；c：術(shù)后3個(gè)月復(fù)查X線片，骨折線清晰可見；d：自體MSCs移植術(shù)后2個(gè)月X線片，骨折線模糊，有骨痂形成；e：自體MSCs移植術(shù)后3個(gè)月X線片，骨折線模糊；f：自體MSCs移植術(shù)后拆除外固定支架X線片

圖2典型病例影像資料(27歲男性，右側(cè)脛腓骨開放性骨折)

由于自體骨髓干細(xì)胞移植治療骨折骨不連存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，整個(gè)過程較單純的紅骨髓移植治療復(fù)雜[10]。主要是由于體外擴(kuò)增這一步驟。其操作也相當(dāng)嚴(yán)格，過程需要嚴(yán)格監(jiān)控。與骨髓干細(xì)胞治療脊髓損傷一樣，必須解決的一個(gè)問題就是過程控制[11]：干細(xì)胞和其他所有相關(guān)準(zhǔn)備材料必須有可以用于追蹤及鑒定的技術(shù)支持和安全的材料來(lái)源；所用的實(shí)驗(yàn)試劑必須有質(zhì)量控制及保證；干細(xì)胞必須保證避免逆轉(zhuǎn)錄病毒以及感染病原體的干擾；另外染色體核型分析技術(shù)要保證干細(xì)胞無(wú)其他的遺傳變異。而解決這一問題需要高額費(fèi)用很高要求的技術(shù)設(shè)備。通常情況下，體外擴(kuò)增人類MSCs需要10%～20%的胎牛血清(FCS)；盡管對(duì)FCS常規(guī)篩測(cè)以滿足細(xì)胞培養(yǎng)的生物安全的需要，然而朊病毒的傳播和未被鑒定的動(dòng)物傳染病等問題，近年來(lái)逐漸引起了重視及關(guān)注[12]。并且在細(xì)胞培養(yǎng)過程中蛋白質(zhì)或多肽可能與MSCs結(jié)合，這可能引起宿主(患者)的免疫排斥反應(yīng)，尤其是需要多次應(yīng)用MSCs治療的患者[13]。因此，在操作過程中，取用患者外周血并分離血清用于MSCs的培養(yǎng)擴(kuò)增，這不僅安全，而且經(jīng)濟(jì)、有效。另外MSCs可能有惡變的可能，須向患者及家屬講明。從本組治療的病例來(lái)看，未出現(xiàn)相關(guān)問題，是一種安全有效的治療方法。

本組病例均采用外固定架固定，主要原因是：開放性損傷、局部皮膚軟組織條件差。由于患肢局部瘢痕愈合，不利于二期切開行堅(jiān)強(qiáng)的鋼板內(nèi)固定及充分植骨(患者及家屬難以接受)，此外該組病例均經(jīng)過2次及2次以上的手術(shù)(清創(chuàng)植皮)，有的骨膜剝離損傷較重，再次手術(shù)操作也勢(shì)必加重骨膜的損傷。所有病例外固定架固定牢靠，且術(shù)前X線證實(shí)，骨折端均無(wú)明顯假關(guān)節(jié)形成的骨折骨不連及不愈合。骨折斷端的穩(wěn)定固定是骨折愈合的重要因素，也是骨髓干細(xì)胞移植治療的基礎(chǔ)。因?yàn)楣钦鄱瞬环€(wěn)定必定帶來(lái)應(yīng)力干擾，從而妨礙了誘導(dǎo)成骨過程，導(dǎo)致成骨障礙，最終影響骨折的愈合。11例中有3例在外院行外固定治療，有2例固定欠佳，應(yīng)用此治療方案前予以外固定調(diào)整使之穩(wěn)定，其余病例固定相當(dāng)牢靠。通常骨折經(jīng)過6～8個(gè)月的治療愈合失敗即可稱為骨折骨不連，骨折部位的不同，骨不連的發(fā)生率也不一樣，大概在5%～23%之間[3]。對(duì)于開放性的脛骨骨折合并局部軟組織損傷，其骨折骨不連的發(fā)生率也許會(huì)更高[2]。因此，對(duì)這類患者，經(jīng)術(shù)后反復(fù)X線檢查見骨折線清晰、未見明顯骨痂生長(zhǎng)，查體局部有壓痛，應(yīng)盡早予以治療。本組患者中平均行該治療時(shí)間為19周，最早的11周，最晚的27周，骨髓干細(xì)胞移植后局部很快就有骨痂形成。對(duì)于有條件的患者，可以重復(fù)、多次行該治療。

經(jīng)皮自體骨髓干細(xì)胞移植治療骨不連有一定的優(yōu)越性：自體骨髓來(lái)源廣泛，采取方便，不受骨不連局部皮膚軟組織條件限制，干細(xì)胞移植可采用局麻，創(chuàng)傷輕，患者痛苦小，操作簡(jiǎn)單安全。對(duì)于患者要求較高者，如拒絕自體髂骨植骨、擔(dān)心取髂骨術(shù)后出現(xiàn)疼痛及影響美觀，不失為一種辦法。但是很多問題仍需要進(jìn)行相關(guān)的研究，注射到骨折局部骨髓量的量化，骨髓干細(xì)胞的濃縮、分離、提純與骨折愈合的量效關(guān)系及預(yù)防在移植部位的異位骨化等問題，具體的成骨機(jī)制問題，以及移植后與干細(xì)胞相關(guān)的如何在體內(nèi)追蹤、標(biāo)記等問題。對(duì)骨缺損嚴(yán)重、存在血管病變的肢體、有慢性骨髓炎及局部感染跡象、有血液系統(tǒng)疾病及骨穿禁忌者一般不主張使用本治療。此外，本組因病例數(shù)較少，未進(jìn)行分組對(duì)照，其臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)仍有待進(jìn)一步研究。

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