長期缺氧對嬰幼兒腸道菌群代謝的影響

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(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院心血管外科，重慶 400037)

馬尿酸是甲苯、苯甲酸等的代謝產(chǎn)物，分子式為C9H9NO3,分子量179。飲食中的芳香族化合物由腸道微生物代謝成苯甲酸，隨后肝腎結(jié)合苯甲酸和甘氨酸，形成馬尿酸。尿液中代謝物的差異反應(yīng)出腸道微生物代謝變化引起的整體結(jié)果，盡管也可能包括宿主代謝途徑的變化。腸道環(huán)境的改變導(dǎo)致了馬尿酸的減少[1-2]。為了研究長期低氧暴露對嬰幼兒體內(nèi)腸道菌群代謝的影響，我院采用核磁共振波譜儀(1H-NMR)檢測紫紺型先天性心臟病嬰幼兒和同齡健康兒童尿液馬尿酸含量，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料

本研究經(jīng)過第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。將法洛四聯(lián)癥患兒10例設(shè)為缺氧組，其中男6例，女4例，年齡21～25個月，體質(zhì)量7.5～11 kg，動脈血氧飽和度70%～86%。10例健康兒童作為對照組，男6例，女4例，年齡20～24個月，體質(zhì)量12～15 kg，動脈血氧飽和度100%。采集清晨空腹尿液,3 000 r/min離心10 min后，置于-20 °C冰箱保存待測。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 儀器：德國Bruker Avance Ⅲ 600 MHz

超導(dǎo)核磁共振波譜儀，配TCI三共振反式超低溫探頭。離心機(jī)德國Eppendorf MiniSpin Plus。試劑：重水美國NORELL公司,99.8%;三甲基硅丙磺酸鈉(DSS)為青島騰龍微波公司進(jìn)口分裝；K2HPO4,NaH2PO4為廣東光華化學(xué)廠有限公司產(chǎn)品。

1.2.2 一維1H-NMR波譜 配制尿液樣品時，尿樣12 000 r/min,離心10 min,取500 μl尿樣，加入250 μl磷酸緩沖液(0.1 mol/L K2HPO4/NaH2PO4，pH=7.4，30%D2O)混合，以消除因pH變化所引起譜圖化學(xué)位移漂移，靜置10 min,離心10 min后,取上層液500 μl移入5 mm NMR樣品管。加入50 μl D2O(用于鎖場)，振蕩混勻。采用預(yù)飽和的1D CPMG脈沖序列。譜寬20 ppm,采用600.13 MHz的質(zhì)子共振頻率，298 K的實(shí)驗(yàn)溫度。采樣時間為0.1 s，弛豫延遲時間為2 s。采樣點(diǎn)數(shù)32 K，累加次數(shù)64次，譜儀偏置設(shè)在水峰的位置，自由感應(yīng)衰減信號經(jīng)過填0為64 K點(diǎn)之后，再加1.00 Hz的線寬因子，經(jīng)傅里葉變換轉(zhuǎn)換為NMR譜圖。每張NMR譜記錄48個FID，采用線寬為1.0 Hz的指數(shù)窗函數(shù)，進(jìn)行傅立葉變換。參照DSS作為化學(xué)位移內(nèi)標(biāo),對1H-NMR譜的化學(xué)位移進(jìn)行定標(biāo)。磁共振波譜儀樣品管內(nèi)DSS濃度40 μg/mL。1維氫譜重要采樣參數(shù)：CPMG:TD=32 K，SW=20 ppm,NS=64,DS=4,D1=2 s,D2O=350 μs,L4=100(2nt=70 ms)。其余采樣參數(shù)如90度脈寬值(P1)及其所對應(yīng)的功率值(PL1)，壓水功率值(PL9)，壓水頻率(O1)，增益值(RG)根據(jù)具體樣品進(jìn)行測定，P1值以接近10 μs為佳。重要處理參數(shù)：SI=64 K,WDW EM,LB=1 Hz,PH_mod pk,Tdeff=0。

1.3 數(shù)據(jù)處理

馬尿酸定量峰的選擇:采用磁共振波譜儀進(jìn)行定量時應(yīng)首先對樣品的各個質(zhì)子峰進(jìn)行歸屬，明確每個質(zhì)子峰所對應(yīng)的質(zhì)子數(shù)。選7.82 ppm含2個氫質(zhì)子的雙峰用于定量。測定選定峰與DSS面積的相對比值，計算含量。

馬尿酸樣品的絕對重量(Wx)由下式求得：Wx=Ws×(Ax/As)×(E/Es)(Ws為內(nèi)標(biāo)物重量；Ax為樣品峰面積；As為內(nèi)標(biāo)物峰面積；E為樣品在該化學(xué)位移處的質(zhì)子當(dāng)量，即E=樣品分子量/產(chǎn)生該共振峰的基團(tuán)中的質(zhì)子數(shù)；Es為內(nèi)標(biāo)物在該化學(xué)位移處的質(zhì)子當(dāng)量，即Es=內(nèi)標(biāo)物分子量/產(chǎn)生該共振峰的基團(tuán)中的質(zhì)子數(shù)。)

1．4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SSPS 13.0軟件，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

患兒與健康兒童尿液1H-NMR譜圖見圖1?；純号c健康兒童尿液馬尿酸濃度分別為(47.15±32.88) mg/L，(346.69±13.55) mg/L，P=0.002。

圖1患兒與健康兒童尿液1H-NMR譜圖(紅色：健康兒童；藍(lán)色：長期缺氧兒童)

3 討論

腸道微生態(tài)系統(tǒng)是機(jī)體最龐大、最重要的微生態(tài)系統(tǒng)。腸道微生態(tài)系統(tǒng)經(jīng)常處于動態(tài)平衡穩(wěn)定之中，同時又容易受到腸道內(nèi)外許多因素影響,導(dǎo)致腸道微生態(tài)紊亂。年齡越小，特別是嬰幼兒腸道微生態(tài)平衡穩(wěn)定非常脆弱，越容易受到各種因素影響，導(dǎo)致嚴(yán)重的腸道微生態(tài)紊亂。

腸道微生菌在膽紅質(zhì)代謝的腸肝循環(huán)中起到十分重要的作用。當(dāng)腸道微生態(tài)平衡穩(wěn)定，膽紅質(zhì)代謝的腸肝循環(huán)得以正常進(jìn)行；相反，若腸道微生態(tài)紊亂，腸道菌叢發(fā)生變化就會干擾膽紅質(zhì)的腸肝循環(huán)，影響肝臟的膽紅質(zhì)代謝，從而影響到肝臟功能。此外，腸道菌群是否平衡穩(wěn)定對腸道上皮細(xì)胞功能也有明顯的影響。腸壁的完整和腸上皮細(xì)胞的正常，對肝臟的營養(yǎng)、物質(zhì)代謝無疑起到良好作用。相反，則肝臟、肝功會受到損傷或加重已發(fā)生的肝損害及肝功能障礙[3]。人體維生素K主要由腸道正常菌群產(chǎn)生和食物供給，其中大多數(shù)維生素由腸道菌合成。腸道菌群紊亂和破壞可引起維生素K依賴性因子缺乏，因而表明腸道正常菌群對維生素K的產(chǎn)生具有重要的作用,是人體維生素K的主要來源[4]。腸道微生物組學(xué)對健康人的重要性，提供新的理解，能夠描繪種屬、個體和群體之間的微生物組學(xué)變化。已經(jīng)明確了腸道微生物組學(xué)在許多疾病病理發(fā)展過程中的重要性，如肥胖、心血管疾病以及炎性腸道疾病。

自從Liebig[5]在1829年第一次確定尿液里的馬尿酸以來，就一直在研究馬尿酸的起源。在20世紀(jì)早期確定人類的馬尿酸是苯甲酸和甘氨酸結(jié)合的產(chǎn)物[6]，即由腸道微生物將飲食中的芳香族化合物代謝成苯甲酸，隨后肝腎結(jié)合苯甲酸和甘氨酸，形成馬尿酸。后期的研究揭示，這是通過一種在肝臟和腎臟線粒體中的苯甲酸輔酶A結(jié)合而成的[7-9]。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，尿液馬尿酸排泄由腸道微生物組成調(diào)節(jié)[10-11]。腸道菌群直接分解苯甲酸產(chǎn)生馬尿酸也是其來源之一[12]。關(guān)于人尿液中排泄?jié)舛龋駮詭r等[13]檢測33名職工尿中馬尿酸值的變化范圍為0～1 250.75 mg/L，呈正態(tài)分布，平均值為479.54 mg/L,標(biāo)準(zhǔn)差為257.07 mg/L。本次研究健康兒童尿液馬尿酸濃度為(346.69±13.55) mg/L，與成人接近。

近年來對健康人群的研究，更深入地了解了腸道細(xì)菌對人體代謝表型的巨大影響[14]。Li等[14]發(fā)現(xiàn)梭狀芽孢桿菌和馬尿酸水平呈正相關(guān)，可能與本研究中馬尿酸減少有關(guān)。與長期缺氧有關(guān)的尿液代謝研究分析了腸道微生物菌群的分子機(jī)制，提示將是更寬廣的研究方向。尿液代謝物水平受到腸道微生物差異的顯著影響，即腸道細(xì)菌代謝、宿主和細(xì)菌分享代謝(共生代謝)產(chǎn)生特異的代謝物[15]。這樣的代謝物可以用作微生物代謝反應(yīng)的標(biāo)志物，反應(yīng)系統(tǒng)功能的差異。利用基于核磁共振的代謝組技術(shù)分析尿液中代謝物的組成，以反映人體整體代謝狀況，可避免技術(shù)困難、方法學(xué)的差異。

苯甲酸是簡單的羧酸，由腸道微生物降解食物中的芳香酸產(chǎn)生，如多酚、嘌呤、芳香有機(jī)酸和氨基酸等。在攝入黑茶、綠茶和紅茶，以及水果、蔬菜豐富的食物后，馬尿酸排泄增加。苯甲酸存在于大量的食物和飲料里，也存在大部分漿果、水果和發(fā)酵的奶產(chǎn)品里，因此患兒及健康兒童均正常進(jìn)食就不會存在苯甲酸攝入不足。

研究長期缺氧嬰幼兒和健康幼兒馬尿酸的尿液排泄，提示腸道菌群在馬尿酸排泄的過程中起關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)馬尿酸水平減少，提示長期缺氧嬰幼兒腸道菌群組成發(fā)生變化，腸道微生物組成及其代謝仍需進(jìn)一步研究。

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