黃連解毒湯合定癇丸治療陽(yáng)癇大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

黎興鍵 吳智兵 于征淼 張小梅

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科，廣東 廣州 510405)

黃連解毒湯合定癇丸治療陽(yáng)癇大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

黎興鍵 吳智兵 于征淼△張小梅

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科，廣東 廣州 510405)

目的觀察黃連解毒湯合定癇丸(湯劑)對(duì)陽(yáng)癇大鼠的抗癇作用。方法以高脂飼料和制附子煎液預(yù)飼養(yǎng)并采用匹羅卡品注射法制成陽(yáng)癇大鼠模型，以黃連解毒湯合定癇丸(湯劑)灌胃治療(陽(yáng)癇中藥組)，同時(shí)設(shè)正常組、陽(yáng)癇組和陽(yáng)癇中藥反治組進(jìn)行對(duì)照，每組各9只觀測(cè)癲癇發(fā)作潛伏期、到達(dá)癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)時(shí)間等癥狀學(xué)指標(biāo)，高效液相色譜法檢測(cè)腦內(nèi)谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)等5種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，伊紅-蘇木素(HE)切片觀察肺、腎、肝、海馬、腦皮質(zhì)的病理變化，免疫組化法測(cè)定腦內(nèi)caspase-3表達(dá)。結(jié)果陽(yáng)癇組、陽(yáng)癇中藥反治組、陽(yáng)癇中藥組大鼠均出現(xiàn)4級(jí)以上癲癇發(fā)作。癲癇發(fā)作潛伏期以陽(yáng)癇組最長(zhǎng)，陽(yáng)癇中藥組次之，陽(yáng)癇中藥反治組最短；到達(dá)SE時(shí)間以陽(yáng)癇中藥組最長(zhǎng)，陽(yáng)癇中藥反治組次之，陽(yáng)癇組最短。各致癇組大鼠腦內(nèi)5種氨基酸含量較正常組均降低。陽(yáng)癇組Glu、Asp與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，GABA、Gly、Ala與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；陽(yáng)癇中藥反治組中各種氨基酸與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；陽(yáng)癇中藥組Glu、Asp、GABA、Gly與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，Ala與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HE切片顯示，正常組大鼠各組織基本正常，其余組大鼠肺、腎、肝、海馬、腦皮質(zhì)等組織均出現(xiàn)明顯病理?yè)p害。陽(yáng)癇組和陽(yáng)癇中藥反治組的腦內(nèi)caspase-3水平高于正常組，其中，陽(yáng)癇中藥反治組升高較明顯，而陽(yáng)癇中藥組則略低于正常組，但比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論黃連解毒湯合定癇丸可能能推遲陽(yáng)癇大鼠SE的到達(dá)時(shí)間，改變部分腦內(nèi)氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)水平，并減少神經(jīng)元凋亡，但作用程度較輕。

癲癇；黃連解毒湯；定癇丸；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

對(duì)于發(fā)作期癲癇，中醫(yī)常分為陽(yáng)癇和陰癇進(jìn)行辨證論治。治療陽(yáng)癇的代表方是黃連解毒湯合定癇丸，治療陰癇的代表方是五生飲合二陳湯[1]。本研究擬建立陽(yáng)癇大鼠模型，并以黃連解毒湯合定癇丸(湯劑)干預(yù)，從動(dòng)物癥狀學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)、主要臟器病理變化、神經(jīng)元凋亡等角度探討其抗癇作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠36只，合格證號(hào)：SCXK(粵)2006-0015，SPF級(jí)，雄性，實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量約(160±20)g，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)[恒溫(26±2) ℃]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境合格證號(hào)：SYXK(粵)2008-0092。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用證明號(hào)：0019724。

1.2 試劑 匹羅卡品(PILO，Sigma，批號(hào)1001059533)、氯化鋰(LiCl，Sigma，批號(hào)MFCD00011078)、硫酸阿托品注射液(天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H41021257)；氨基酸對(duì)照品(amino acid stadard H，PIERCE)、GABA對(duì)照品(Sigma)、衍生劑AQC(Waters，批號(hào)1383803631)、醋酸鈉緩沖液(Waters，批號(hào)4082110911)；Rabbit anti caspase-3(cell signaling)、EnVision試劑(Dako)。

1.3 儀器 Waters 2695高效液相色譜(HPLC)儀，Waters 2475熒光檢測(cè)器，Empower色譜工作站(Waters)。

1.4 藥物 制附子煎液：制附子15g，加水300mL煮沸1 h，約得溶液220mL。黃連解毒湯合定癇丸(湯劑)：丹參、麥門冬各90g，明天麻、浙貝母、法半夏、茯苓、茯神、生姜各45g，天竺黃、甘草、黃連、梔子各27 g，黃芩、黃柏、膽南星、石菖蒲、全蝎、僵蠶、陳皮、遠(yuǎn)志各15g，琥珀4.5g，朱砂1.5g，以350mL水煎沸除琥珀和朱砂以外的中藥40min，后將琥珀和朱砂兌入拌勻，約得150mL藥液(含生藥約4.5g/mL)。減味五生飲合二陳湯：法半夏、橘紅、生姜各45g，茯苓、烏梅各27 g，黑豆衣、生天南星、生半夏、白附子、炙甘草各15g，以300mL水先煎生半夏、生天南星，煮沸40min，加入其余藥物再煎30min，約得150mL藥液(含生藥約1.8 g/mL)。

1.5 分組及造模 隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，按體質(zhì)量將動(dòng)物分成9個(gè)區(qū)組，4只/區(qū)組。然后隨機(jī)分入4組：正常組、陽(yáng)癇組、陽(yáng)癇中藥反治組、陽(yáng)癇中藥組，每組9只。以普通飼料及過(guò)濾水喂養(yǎng)正常組，以高脂飼料及制附子煎液喂養(yǎng)其它3組。高脂飼料由普通飼料摻入膽固醇、奶粉、白糖、豬油等制成，每1 g提供熱量約18.84kJ。每次取制附子煎液45mL，加水稀釋至300mL，供1籠大鼠(9只)飲用24h，為惟一水源，各組喂養(yǎng)時(shí)間均為10周。然后，正常組予0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。其余3組予LiCl+PILO腹腔注射：共進(jìn)行3次注射，第1次用LiCl 127 mg/kg，17.5h后用阿托品1 mg/kg，再30min后用PILO 50mg/kg。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物癲癇發(fā)作級(jí)別評(píng)定根據(jù)Racine分級(jí)[2]。本研究規(guī)定出現(xiàn)4級(jí)或以上發(fā)作或癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)者為造模成功。

1.6 給藥 各組均在首次腹腔注射后17 h灌胃給藥(20mL/kg)：正常組、陽(yáng)癇組予0.9%氯化鈉注射液，陽(yáng)癇中藥反治組予減味五生飲合二陳湯，陽(yáng)癇中藥組予黃連解毒湯合定癇丸(湯劑)。

1.7 觀察指標(biāo) 記錄各組大鼠癲癇發(fā)作潛伏期(自注射PILO到大鼠首次出現(xiàn)癲癇發(fā)作的時(shí)間)、發(fā)作程度分級(jí)及到達(dá)SE時(shí)間(自注射PILO到大鼠SE的時(shí)間)。注射PILO后60min予腹腔注射10%水合氯醛(300mg/kg)終止發(fā)作并處死所有大鼠。HPLC法檢測(cè)腦內(nèi)谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)5種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的含量；伊紅-蘇木素(HE)切片觀察肺、腎、肝、海馬、腦皮質(zhì)等的病理變化；免疫組化法測(cè)定腦內(nèi)caspase-3表達(dá)(每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野測(cè)定陽(yáng)性面積，取均值作為測(cè)定結(jié)果)。HE切片及免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。

2 結(jié) 果

2.1 各組氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)比較 見(jiàn)表1。

組 別nGluAspGABAGlyAla正常組90．057±0．0310．029±0．0160．080±0．0250．058±0．0140．023±0．008陽(yáng)癇組90．034±0．006?0．013±0．005??0．067±0．0180．050±0．0100．019±0．005陽(yáng)癇中藥反治組90．033±0．005??0．012±0．003??0．056±0．009??0．045±0．007??0．017±0．003?陽(yáng)癇中藥組90．033±0．005?0．015±0．004??0．064±0．010?0．048±0．008?0．019±0．004

與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01

由表1可見(jiàn)，各致癇組大鼠腦內(nèi)5種氨基酸含量較正常組均降低。陽(yáng)癇組Glu、Asp與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，GABA、Gly、Ala與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；陽(yáng)癇中藥反治組中各種氨基酸與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；陽(yáng)癇中藥組Glu、Asp、GABA、Gly與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，Ala與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其中Asp、Ala水平在所有致癇組中降幅最小。

2.2 各組癥狀學(xué)比較 見(jiàn)表2。

組 別n癲癇發(fā)作潛伏期到達(dá)SE時(shí)間正常組9--陽(yáng)癇組91．591±0．46117．886±8．880陽(yáng)癇中藥反治組91．305±0．54623．912±6．617陽(yáng)癇中藥組91．383±0．54626．069±10．512

由表2可見(jiàn)，除正常組大鼠未見(jiàn)癲癇發(fā)作外，陽(yáng)癇組、陽(yáng)癇中藥反治組、陽(yáng)癇中藥組大鼠均出現(xiàn)4級(jí)以上癲癇發(fā)作。癲癇發(fā)作潛伏期以陽(yáng)癇組最長(zhǎng)，陽(yáng)癇中藥組次之，陽(yáng)癇中藥反治組最短；到達(dá)SE時(shí)間以陽(yáng)癇中藥組最長(zhǎng)，陽(yáng)癇中藥反治組次之，陽(yáng)癇組最短。

2.3 各組肺、腎、肝、海馬、腦皮質(zhì)病理變化 HE切片顯示，正常組大鼠各組織基本正常。其余組大鼠肺、腎、肝、海馬、腦皮質(zhì)等組織均出現(xiàn)明顯病理?yè)p害：肺泡壁增厚，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分出血嚴(yán)重，部分損傷嚴(yán)重；腎小球結(jié)構(gòu)輕度破壞，系膜增生，腎小管結(jié)構(gòu)破壞，部分大鼠腎小管結(jié)構(gòu)模糊，重度水腫；肝細(xì)胞濁腫，肝索排列混亂，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；海馬結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，神經(jīng)元細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷；腦皮質(zhì)星形細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增多，部分大鼠皮層組織破壞。各致癇組損害嚴(yán)重程度無(wú)明顯差別。見(jiàn)封3，圖1-20。

2.4 各組腦內(nèi)caspase-3表達(dá)比較 見(jiàn)表3。

組 別ncaspase-3表達(dá)陽(yáng)性面積正常組98．833±2．758陽(yáng)癇組98．917±6．156陽(yáng)癇中藥反治組913．500±10．405陽(yáng)癇中藥組98．417±4．379

由表3可見(jiàn)，陽(yáng)癇組和陽(yáng)癇中藥反治組的腦內(nèi)caspase-3水平高于正常組，其中陽(yáng)癇中藥反治組升高較明顯，而陽(yáng)癇中藥組則略低于正常組，但比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

陰癇和陽(yáng)癇中的“陰”和“陽(yáng)”指癲癇頻繁發(fā)作之時(shí)的證候寒熱屬性，陽(yáng)癇的病機(jī)為痰熱蒙蔽心神。本研究使用黃連解毒湯合定癇丸(湯劑)治療陽(yáng)癇大鼠模型。

首先觀測(cè)了發(fā)作潛伏期、到達(dá)SE時(shí)間等癥狀學(xué)指標(biāo)，結(jié)果顯示，到達(dá)SE時(shí)間以陽(yáng)癇中藥組最長(zhǎng)，陽(yáng)癇中藥反治組次之，陽(yáng)癇組最短。

其次，使用HPLC檢測(cè)腦內(nèi)5種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)。氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)一類重要的遞質(zhì)。Glu、Asp為興奮性氨基酸，對(duì)CNS有興奮效應(yīng)。GABA、Gly、Ala為抑制性氨基酸，對(duì)CNS有抑制效應(yīng)[3]。這些遞質(zhì)的失衡參與了癲癇的發(fā)病過(guò)程[4-7]。關(guān)于癲癇動(dòng)物腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的變化，文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不一。PILO致癇大鼠腦皮質(zhì) Glu、Gly，海馬區(qū)Gly、Asp[8]及其外液中GABA濃度升高[9]。PILO致癇小鼠的小腦內(nèi)Ala濃度亦顯著增高[10]。但戊四唑點(diǎn)燃癲癇大鼠海馬、紋狀體內(nèi) Glu、Ala、Gly濃度則降低，GABA濃度無(wú)變化[11]。氯化鐵微注射誘導(dǎo)的癲癇大鼠可出現(xiàn)腦皮質(zhì)內(nèi)Asp、GABA濃度下降，Ala、Gly濃度上升，而Glu濃度則無(wú)變化[12]。本研究結(jié)果顯示，各致癇組大鼠腦內(nèi)5種氨基酸濃度均較正常組降低，陽(yáng)癇中藥組的Asp、Ala降幅最小，最接近正常大鼠的水平，其中Asp降幅差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果并不一致，提示氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)在癲癇中雖然具有肯定的病理意義，但其機(jī)制卻具有復(fù)雜性。

再次，HE切片觀察肺、腎、肝、海馬、腦皮質(zhì)的病理變化，結(jié)果顯示，各致癇組大鼠肺、腎、肝、海馬、大腦皮質(zhì)等組織均出現(xiàn)明顯病理?yè)p害，提示癲癇頻繁發(fā)作對(duì)多個(gè)重要臟器均有明顯損害作用。

最后，使用免疫組化技術(shù)測(cè)定了腦內(nèi)caspase-3表達(dá)。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的蛋白酶家族，其核心蛋白是caspase-3[13-14]。研究表明，癲癇患者及動(dòng)物腦內(nèi)caspase-3較正常水平顯著升高，抑制caspase-3的激活對(duì)癲癇具有治療作用[15-16]。本研究結(jié)果顯示，陽(yáng)癇組和陽(yáng)癇中藥反治組腦內(nèi)caspase-3水平高于正常組，而陽(yáng)癇組則略低于正常組，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

上述結(jié)果雖然大多缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但可發(fā)現(xiàn)陽(yáng)癇中藥組的某些指標(biāo)具有病情減輕的趨勢(shì)，可以推測(cè)，黃連解毒湯合定癇丸可能能夠推遲陽(yáng)癇大鼠SE的到達(dá)時(shí)間，改變腦內(nèi)部分氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的水平，并減少神經(jīng)元凋亡。

缺乏有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義陽(yáng)性結(jié)果的原因可能有三：①數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差大；②指標(biāo)不夠敏感；③黃連解毒湯合定癇丸的藥效特點(diǎn)是同時(shí)對(duì)癲癇的多個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行細(xì)微的干預(yù)。

另外，目前國(guó)內(nèi)癲癇動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均使用西醫(yī)病理模型，尚無(wú)具備中醫(yī)證候特點(diǎn)的癲癇動(dòng)物模型。本研究使用高脂飼料和制附子煎液預(yù)飼養(yǎng)，PILO注射法制作陽(yáng)癇大鼠模型，并予治療陽(yáng)癇的代表方黃連解毒湯合定癇丸進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)用藥性相反的減味五生飲合二陳湯作為反治對(duì)照方，以評(píng)價(jià)模型的證候特點(diǎn)。結(jié)果顯示，陽(yáng)癇中藥組到達(dá)SE時(shí)間長(zhǎng)于陽(yáng)癇中藥反治組和陽(yáng)癇組，陽(yáng)癇中藥組的Asp、Ala最接近正常大鼠水平，caspase-3表達(dá)量最低。這些結(jié)果都提示了該模型可能具有陽(yáng)癇的中醫(yī)證候特點(diǎn)。

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(本文編輯：李珊珊)

ExperimentalstudyofHuanglianJiedudecoctioncombinedwithDingxianPillonYangxianEpilepticRats

LIXingjian,WUZhibing,YUZhengmiao,etal.

DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangdong,Guangzhou510405

ObjectiveTo explore anti-epileptic effects of Huanglian Jiedu decoction combined with Dingxian Pill on pilocarpine-yangxian epileptic rats.MethodsThe yangxian epileptic rat models were established by intraperitoneal injection of pilocarpine after being pretreated with high fat diet and Radix Aconiti Lateralis Preparata decoction. Then, they were treated with Huanglian Jiedu decoction and Dingxian Pill, which were referred as the yangxian Chinese medicine (CM) group. At the same time, the normal group, the yangxian group, and the yangxian CM converse therapy group were established to serve as controls. Symptomatological indexes like time spots of seizure latency period and status epilepticus (SE) were recorded; concentrations of five amino acid neurotransmitters in the brains including glutamic acid (Glu), aspartic acid (Asp), gamma-aminobutyric acid(GABA), glycine (Gly), and alanine (Ala) were detected by high-performance liquid chromatography; pathological changes including the lung, the kidney, the liver, the hippocampus and the cortex were observed by HE staining; the expression of caspase-3in brains were examined by immunohistochemisty.ResultsClass 4-5seizures were observed in all the rats in the yangxian group, the yangxian CM converse therapy group, and the yangxian CM group. The seizure latency period of the yangxian group was the longest, followed by the yangxian CM group, and the yangxian CM converse therapy group was the shortest. The latency time of SE of the yangxian CM group was the longest, and the yangxian group was the shortest, whereas the yangxian CM converse therapy group was in the midst. All the concentrations of the five amino acids in brains of epileptic rats decreased when compared with the normal group. Compared with the normal group, there were significant decrease in the concentrations of Glu and Asp of the yangxian group, all the amino acids of the yangxian CM converse therapy group, and Glu, Asp, GABA and Gly of the yangxian CM group (P<0.05，P<0.01). However, GABA, Gly and Ala of the yangxian group, and Ala of the yangxian CM group were no statistically significant decline (P>0.05). HE stain indicated severe damage in the lung, the kidney, the liver, the hippocampus and the cortex of all the epileptic rats, while all the tissues mentioned above of the normal group were normal. The expression of caspase-3of the yangxian group and the yangxian CM converse therapy group, which had more obvious elevation, ascended, while the yangxian CM group mildly descended as compared with the normal group, but there was no statistical difference among all the groups.ConclusionHuanglian Jiedu decoction combined with Dingxian Pill would delay the occurrence of SE of the yangxian epileptic rats, regulate part of the concentrations of the amino acid neurotransmitters in brains, and prohibit apoptosis of neurons.

Epilepsy; Huanglian Jiedu decoction; Dingxian Pill; Animal experiment

黎興鍵(1985—)，男，碩士。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)病學(xué)。

R742.1

A

1002-2619(2014)09-1388-04

2013-09-17)

△ 通訊作者：廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科，廣東 廣州 510405