響應(yīng)面法酶解剩余活性污泥中微生物蛋白質(zhì)研究

趙向陽, 王 茜， 陳曉剛， 陳 忻*， 陳小輝， 何綺樺

(1.佛山市水業(yè)集團(tuán)有限公司,佛山 528000；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院化學(xué)與化工系，佛山 528000)

活性污泥法是目前應(yīng)用最廣泛的污水處理方法之一，具有效率高、占地少等優(yōu)點(diǎn).剩余活性污泥是活性污泥流程中經(jīng)二沉池沉淀后排除的部分活性污泥，由于含水率高、有惡臭，且含有毒化學(xué)物質(zhì)和病原微生物，若不加以控制，勢(shì)必造成第二次污染[1-2].目前主要控制手段包括剩余活性污泥的減量化、無害化處理以及資源化再利用.具體包括：大海投棄、土地填埋、焚燒處理和土地利用[3].但是大海投棄對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)和人類食物鏈構(gòu)成威脅；土地填埋占用大量土地，對(duì)環(huán)境造成二次污染；焚燒處理形成大量含有重金屬和毒性有機(jī)物的煙霧而污染大氣，且處理費(fèi)用昂貴；若將污泥作為有機(jī)肥料資源長(zhǎng)期施用于土地，污泥中的重金屬離子、有毒有機(jī)物會(huì)積累并影響人體健康.

從資源化方向上來說，剩余活性污泥中含大量的微生物單細(xì)胞蛋白質(zhì)[4-6]，分解后可以制備價(jià)值高、用途廣的中間原料[7-8]，達(dá)到減量化、無害化、資源化的目的.而從活性污泥中分解蛋白質(zhì)作為中間原料的研究方法主要有酸水解法、堿水解法、超聲波輔助法和酶解法[9].前3種方法在實(shí)際生產(chǎn)中，存在反應(yīng)條件劇烈、對(duì)設(shè)備的要求高、對(duì)環(huán)境容易造成嚴(yán)重污染等問題.而利用酶解法水解污泥蛋白具有反應(yīng)條件溫和、酶解效率高、反應(yīng)物(蛋白酶)及產(chǎn)物易降解，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染的特點(diǎn)，但目前相關(guān)的研究報(bào)道較少[9].

響應(yīng)面分析法(Response SurfaceMethodology,簡(jiǎn)稱RSM)是由一組數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法組成，可用于一個(gè)或多個(gè)響應(yīng)值與幾種因素之間的關(guān)系，確定各因素及其交互作用在加工過程中對(duì)非獨(dú)立變量的影響，給出一個(gè)數(shù)學(xué)模型，精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，同時(shí)可根據(jù)數(shù)學(xué)模型控制響應(yīng)值，選擇不同的操作參數(shù)[10].目前利用響應(yīng)面分析法的研究主要集中在優(yōu)化工藝條件，對(duì)回歸方程、等值線、響應(yīng)曲線的分析應(yīng)用相對(duì)還較少[11].

本研究以剩余活性污泥為原料，探討蛋白酶的種類、體系溫度、酶解時(shí)間、酶用量、液固比、體系pH等因素對(duì)污泥蛋白質(zhì)分解率的影響及變化規(guī)律后采用響應(yīng)面分析法研究最佳工藝條件，以期為剩余活性污泥資源化利用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料 經(jīng)過消化、脫水的新鮮剩余活性污泥，由佛山市水業(yè)集團(tuán)鎮(zhèn)安污水處理廠提供，平均含水率為41.71%.

1.1.2 主要儀器 SHZ-82A 恒溫水浴振蕩器：金壇市富華儀器有限公司；pHS-3C型精密pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；FA2004N 電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；KDN-102C 型定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；SYC-15 超級(jí)恒溫水浴：南京桑力電子設(shè)備廠；電爐：中國廣州電子瓦礃廠；800B低速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；85-Z恒溫磁力攪拌器：常州市國華儀器廠；ZK-82B真空干燥箱：上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠.

1.1.3 主要試劑 酸性蛋白酶(3×105U/g) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中性蛋白酶(1.5×105U/g)：諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；木瓜蛋白酶(3×105U/g)：東莞市華琪生物科技有限公司；堿性蛋白酶(2×105U/g)：南寧龐博生物工程有限公司；硫酸銅為化學(xué)純,硫酸鉀、濃硫酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠都為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 剩余活性污泥中微生物蛋白質(zhì)的酶水解提取的工藝流程(圖1)

圖1 剩余活性污泥中微生物蛋白質(zhì)的酶水解工藝流程圖

Figure 1 Enzymatic hydrolysis process of microbial protein in residual activated sludge

1.2.2 蛋白酶的選擇 稱取2.5 g經(jīng)過消化、脫水的剩余活性污泥，根據(jù)購買時(shí)廠家提供各種酶適用的pH范圍，按照表1酶解條件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn).

表1 酶解條件設(shè)計(jì)表Table 1 Conditions of enzymatic hydrolysis

酶解后在100 ℃下滅活15 min，在轉(zhuǎn)速4 000 r/min下離心15 min，用凱氏定氮法測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)含量，并比較各種酶的分解率.

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 根據(jù)GB 5009.5-2010， 粗蛋白含量的測(cè)定采用半微量凱氏定氮法進(jìn)行.計(jì)算方法如下：

(1)

式中：X為試樣中蛋白質(zhì)的含量(g/100 g)；V1為硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積(mL)；V2為試劑空白消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積(mL)；V3為吸取消化液的體積(mL)；c為硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度(mol/L)；0.014 0為1.0 mL硫酸[c(1/2H2SO4)=1.000 mol/L]相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量(g)；m為試樣的質(zhì)量(g)；F為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)6.25.

1.2.4 蛋白質(zhì)分解率的測(cè)定 蛋白質(zhì)分解率PEE(%)按式(2)進(jìn)行計(jì)算：

(2)

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

(1)體系pH的選擇 稱取2.5 g經(jīng)過消化、脫水的新鮮剩余活性污泥6份，按液固比4.0∶1.0加入去離子水，配制成污泥料液，并分別調(diào)節(jié)體系pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；向預(yù)處理好的污泥料液中加入3%的木瓜蛋白酶，在恒定溫度55 ℃下，連續(xù)攪拌4.0 h.反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算提取液中蛋白質(zhì)的分解率.

(2)液固比的選擇 稱取2.5 g經(jīng)過消化、脫水的新鮮剩余活性污泥5份，分別按液固比3.0∶1.0、3.5∶1.0、4.0∶1.0、4.5∶1.0、5.0∶1.0、5.5∶1.0，加入去離子水，配制成污泥料液，并調(diào)節(jié)體系pH為7.0；向預(yù)處理好的污泥料液中加入3%的木瓜蛋白酶，在恒定溫度55 ℃下，連續(xù)攪拌4.0 h.反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算提取液中蛋白質(zhì)的分解率.

(3)酶解時(shí)間的選擇 稱取2.5 g經(jīng)過消化、脫水的新鮮剩余活性污泥6份，按液固比4.0∶1.0加入去離子水，配制成污泥料液，并調(diào)節(jié)體系pH為7.0；向預(yù)處理好的污泥料液中加入3%的木瓜蛋白酶，在恒定溫度55 ℃下，連續(xù)攪拌1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 h.反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算提取液中蛋白質(zhì)的分解率.

(4)酶用量的選擇 稱取2.5 g經(jīng)過消化、脫水的新鮮剩余活性污泥6份，按液固比4.0∶1.0加入去離子水，配制成污泥料液，并調(diào)節(jié)體系pH為7.0；向預(yù)處理好的污泥料液中分別加入1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的木瓜蛋白酶，在恒定溫度55 ℃下，連續(xù)攪拌4.0 h.反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算提取液中蛋白質(zhì)的分解率.

(5)酶解溫度的選擇 稱取2.5 g經(jīng)過消化、脫水的新鮮剩余活性污泥6份，按液固比4.0∶1.0加入去離子水，配制成污泥料液，并調(diào)節(jié)體系pH為7.0；向預(yù)處理好的污泥料液中加入3%的木瓜蛋白酶，分別在恒定溫度45、50、55、60、65、70 ℃下，連續(xù)攪拌4.0 h.反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算提取液中蛋白質(zhì)的分解率.

2 結(jié)果與討論

2.1 4種不同酶酶解剩余活性污泥中蛋白質(zhì)的作用

結(jié)果表明，利用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解剩余活性污泥中的微生物蛋白質(zhì)，分解率最高(圖2)，其次是堿性蛋白酶，其他蛋白酶的提取效果較差，選取木瓜蛋白酶用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

圖2 4種酶酶解剩余活性污泥中的蛋白質(zhì)

Figure 2 Enzymatic hydrolysis results by four different enzymes

2.2 影響酶解法的因素

隨著污泥料液體系pH值的增大，木瓜蛋白酶對(duì)剩余活性污泥中蛋白質(zhì)分解率相應(yīng)的增大，當(dāng)體系pH為7.0時(shí)，蛋白質(zhì)分解率最高(圖3A).

隨著液固比的增大，蛋白質(zhì)分解率相應(yīng)的增大，當(dāng)液固比在4.0∶1.0的時(shí)，蛋白質(zhì)分解率最大(圖3B).

酶解時(shí)間為1.0～4.0 h時(shí)，蛋白質(zhì)分解率隨著時(shí)間增加而增大(圖3C)，在4.0 h后隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)分解率增幅不大.因此確定酶解時(shí)間為4.0 h，并把酶解時(shí)間2.0～6.0 h作為響應(yīng)面法的考察范圍.

在剩余活性污泥中加大酶用量，蛋白質(zhì)分解率增加，當(dāng)酶用量在3.0%時(shí)蛋白質(zhì)分解率達(dá)到最大(圖3D).因此確定把酶用量2.0%～4.0%作為響應(yīng)面法的考察范圍.

隨著酶解溫度的升高，蛋白質(zhì)分解率增大，酶解溫度在55 ℃時(shí)木瓜蛋白酶的蛋白質(zhì)分解率最高(圖3E)，因此確定酶解溫度55 ℃，并把酶解溫度45～65 ℃作為響應(yīng)面法的考察范圍.

2.3 酶解的響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析

采用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，在pH為7.0，液固比為4.0∶1.0的條件下，以酶解時(shí)間(Y1)為(2.0～6.0 h)、酶解溫度(Y2)(45～65 ℃)和酶(E)與底物(S)質(zhì)量比E/S(Y3)(1.0∶100～3.0∶100)3個(gè)主要因素，建立回歸模型，對(duì)蛋白質(zhì)分解率進(jìn)行預(yù)測(cè).剩余活性污泥中微生物蛋白質(zhì)分解率與各因素之間的相互關(guān)系式用三元二次多項(xiàng)式預(yù)測(cè):

(3)

方程中，Y1、Y2和Y3是自變量，a0,…,a9為回歸系數(shù)，建立的回歸模型是否與實(shí)際情況擬合是由R2決定系數(shù)與方差分析共同評(píng)價(jià)的.

2.3.1 回歸模型的建立 根據(jù)二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理，本試驗(yàn)所確定的原變量與編碼變量之間的關(guān)系見表2.三因素二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)矩陣見表3.

圖3 體系不同影響因素對(duì)蛋白質(zhì)分解率的影響

Figure 3 The influences of different effectors on protein extraction rate

表2試驗(yàn)因素水平編碼值表

Table 2 Coded values and corresponding actual values of optimization parameters

由表3發(fā)現(xiàn)，變量Y1的取值范圍為2.0≤Y1≤6.0，變量Y2的取值范圍為45≤Y2≤65，變量Y3的取值范圍為1.0≤Y3≤3.0，變量Y1、Y2、Y3三者的取值范圍相差較大，因此需要先進(jìn)行歸一化處理，即X1=Y1/2，X2=Y2/20，X3=Y3.

利用SAS 9.0軟件對(duì)表3進(jìn)行處理，得到了剩余活性污泥中微生物蛋白質(zhì)分解率PEE(Y)與各因素之間的相互關(guān)系式.

Y=-106.94+41.42X1+103.75X2-17.659X3-

10.53X1X3+19.95X2X3.

(4)

由表4可知，酶解時(shí)間極差達(dá)16.5，說明酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)分解率的影響最大，取水平0為最好，即酶解時(shí)間4.0 h；酶解溫度極差達(dá)為6.96，對(duì)蛋白質(zhì)分解率的影響僅此于酶解時(shí)間，其中取水平0時(shí)，即酶解溫度55 ℃；對(duì)于酶用量，其極差較少，取水平2為最好，即酶用量3.0%.

2.3.2 回歸模型的分析 表5為響應(yīng)面的二次模型方差分析，表6是二次回歸模型的參數(shù).從表5中可以看出模型F值為27.30，P<0.05，表明總體上模型因素水平項(xiàng)顯著.回歸方程的擬合度是92.47% (R2=0.924 7)，即由二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)所獲得的回歸方程與實(shí)際情況擬合較好.

2.3.3 酶解時(shí)間與酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)分解率的影響 在E∶S為3.0%的條件下，應(yīng)用Design Expert軟件對(duì)酶解時(shí)間與酶解溫度的回歸模型進(jìn)行分析.從圖4來看，隨著溫度的升高，在剩余活性污泥中蛋白質(zhì)分解率呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)溫度上升至58 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)分解率開始下降.酶解時(shí)間從2.0～5.0 h過程中，蛋白質(zhì)分解率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，4.8 h達(dá)到最大值，之后呈下降趨勢(shì).

2.3.4 酶解時(shí)間與E∶S對(duì)蛋白質(zhì)分解率的影響 在酶解溫度為55 ℃的條件下，應(yīng)用Design Expert軟件對(duì)酶解時(shí)間和E∶S的回歸模型進(jìn)行分析.從圖5來看，當(dāng)E∶S在1.0%～3.0%過程中，蛋白質(zhì)分解率呈上升趨勢(shì)，E∶S在2.8%左右，蛋白質(zhì)分解率最高.酶解溫度在45～60 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)分解率持續(xù)升高，酶解溫度在58 ℃的時(shí)候達(dá)到最大值.

表3二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)方案與結(jié)果

Table 3 Quadratic orthogonal rotation combination design and results

NO設(shè)計(jì)矩陣試驗(yàn)方案Y1Y2Y3Y1/hY2/℃Y3/%PEEY/%1-2-2-22.0451.029.83 2-2-1-12.0501.531.23 3-2002.0552.032.25 4-2112.0602.529.45 5-2222.0653.028.05 6-1-1-23.0501.039.77 7-10-13.0551.540.16 8-1103.0602.034.42 9-1213.0652.532.32 10-1-223.0453.039.77 1100-24.0551.049.34 1201-14.0601.543.34 130204.0652.041.72 140-214.0452.548.76 150-124.0503.050.16 1611-25.0601.043.03 1712-15.0651.537.93 181-205.0452.046.05 191-115.0502.540.79 201025.0553.043.34 2122-26.0651.031.42 222-2-16.0451.536.97 232-106.0502.038.75 242016.0552.541.18 252126.0603.036.72 2600-24.0551.049.34 2700-14.0551.551.89 280004.0552.052.08 290014.0552.553.06 300024.0553.053.29

表4 正交試驗(yàn)的極差分析Table 4 Range analysis of orthogonal test

表5 回歸方程的方差分析Table 5 Variance analysis of the regression equation

表6 二次回歸模型參數(shù)Table 6 Quadratic regression model parameters

2.3.5 酶解溫度與E∶S對(duì)蛋白質(zhì)分解率的影響 在固定酶解時(shí)間為4.0 h的情況下，應(yīng)用Design Expert軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，由圖6可知酶用量在3.0%左右分解率較高，約在55 ℃時(shí)蛋白質(zhì)的分解率達(dá)到最大值.

2.3.6 酶解最優(yōu)工藝參數(shù)的確定 由表3、表4及歸一化分析可知，當(dāng)X1=2.0；X2=2.75；X3=3.0時(shí)，蛋白質(zhì)分解率最高.對(duì)響應(yīng)面結(jié)果利用軟件進(jìn)行優(yōu)化分析，為了使Y取得最大值，需使得Y關(guān)于X1,X2,X3的一階偏導(dǎo)數(shù)為零. 對(duì)式(4)

Y=-106.941 96+41.417 08X1+103.749 12X2-

19.953 57X2X3

求導(dǎo)：

并分別把X2=2.75、X3=3.0，X1=2.0、X3=3.0，X1=2.0、X2=2.75代入(5)～(7),求解得

圖4 酶解溫度與酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)分解率的影響

Figure 4 The influences of enzymatic hydrolysis temperature and time on protein extraction rate

圖5 酶解時(shí)間與E∶S對(duì)蛋白質(zhì)分解率的影響

圖6 酶解溫度與E∶S對(duì)蛋白質(zhì)分解率的影響

X1=1.9，X2=2.9，X3=2.4.由此可得出3組最優(yōu)解，即最優(yōu)提取工藝條件如下：

第一組：X1=1.9，X2=2.75，X3=3.0.

第二組：X1=2.0，X2=2.9，X3=3.0.

第三組：X1=2.0，X2=2.75，X3=2.4.

把以上3組結(jié)果分別代入式(4)，得Y值分別為：52.55%,52.82%,53.53%.

2.3.7 回歸模型的檢驗(yàn) 為進(jìn)一步驗(yàn)證該回歸模型是否對(duì)提取剩余活性污泥中微生物蛋白質(zhì)工藝具有預(yù)測(cè)及控制的作用.利用3組酶解條件：X1=1.9,X2=2.75，X3=3.0；X1=2.0，X2=2.9,X3=3.0；X1=2.0，X2=2.75，X3=2.4分別對(duì)剩余活性污泥進(jìn)行酶解(表7)，實(shí)際測(cè)定的蛋白質(zhì)分解率與由回歸模型計(jì)算所得值的蛋白質(zhì)分解率非常相近，這充分反映出該模型具有強(qiáng)大的分析能力，可為實(shí)際操作提供良好的指導(dǎo).

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of validation experiment

3 結(jié)論

采用酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)活性污泥進(jìn)行酶解，確定木瓜蛋白酶的蛋白質(zhì)分解率最高，其次是堿性蛋白酶，其他蛋白酶的提取效果較差.

通過二次正交旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并利用SAS軟件得到木瓜蛋白酶對(duì)剩余活性污泥中蛋白質(zhì)分解率與酶解時(shí)間、酶解溫度、酶用量的回歸模型，該回歸模型的擬合優(yōu)度達(dá)92.47%，回歸模型與實(shí)際情況較為相近.

采用響應(yīng)面分析法對(duì)酶解法提取剩余活性污泥中微生物蛋白質(zhì)工藝進(jìn)行優(yōu)化，最優(yōu)工藝條件為：液固比4.0∶1.0，pH 7.0，酶解時(shí)間為4.0 h，酶解溫度約為58 ℃，E∶S約為3.0%，蛋白質(zhì)分解率可達(dá)到53.29%，該值與響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)值52.82%非常接近，說明響應(yīng)面模型可以很好的應(yīng)用于酶解工藝條件的優(yōu)化.

本文在設(shè)計(jì)回歸模型時(shí)，只考慮了酶解時(shí)間、酶解溫度、E∶S 3個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)分解率的影響，對(duì)于液固比、體系pH值等因素對(duì)蛋白質(zhì)分解率的影響，以及酶解的機(jī)理探究等有待深入研究.

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