魚(yú)肉中磺胺類抗生素的表面增強(qiáng)拉曼光譜探測(cè)與分析

馬海寬，韓曉紅，張財(cái)華，張 旭，史曉鳳，馬 君

(中國(guó)海洋大學(xué)光學(xué)光電子實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266100)

0 引言

二十世紀(jì)三十年代，磺胺類抗生素被發(fā)現(xiàn)可有效治療感染性疾病后，被長(zhǎng)期用于臨床治療[1]。近年來(lái)，磺胺類抗生素在水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)中的濫用對(duì)人體健康及生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)磺胺類抗生素殘留的檢測(cè)方法主要包括理化檢測(cè)法、生物測(cè)定法及免疫分析法[2]。這些方法雖然靈敏度比較高，但是儀器和材料價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，很難實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)探測(cè)。目前，急需一種可檢測(cè)水產(chǎn)品中殘留痕量抗生素的簡(jiǎn)單、快速、便捷的方法。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface-enhanced Raman Spectroscopy, SERS)技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、方便、高靈敏度、高準(zhǔn)確度的痕量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)檢測(cè)分子發(fā)生諧振時(shí)，增強(qiáng)效果可達(dá)1014-1015倍[3, 4]，在理論上可達(dá)到單分子檢測(cè)的水平，在多個(gè)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究小組相繼將SERS技術(shù)應(yīng)用于對(duì)抗生素的檢測(cè)與分析，并取得了一定的成果。2006年，羅馬尼亞的Lliescu[5]等人利用銀溶膠作為增強(qiáng)基底對(duì)青霉素鉀進(jìn)行了拉曼光譜探測(cè)。2011年，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)的陳乾旺[6]等人制備了空心金納米材料，并以此為增強(qiáng)基底對(duì)四環(huán)素溶液進(jìn)行SERS光譜檢測(cè)，能夠檢測(cè)到的最低濃度為0.1 ppb。2013年，上海海洋大學(xué)的賴克強(qiáng)[7]等人用購(gòu)買的Klarite材料作增強(qiáng)基底對(duì)魚(yú)肉中孔雀石綠和結(jié)晶紫進(jìn)行SERS光譜探測(cè)，能夠檢測(cè)的最低濃度分別為10 ppb和15 ppb。2013年，中國(guó)海洋大學(xué)馬君[8]等利用自組裝法制備了銀溶膠膜，使用顯微拉曼系統(tǒng)對(duì)氯霉素、環(huán)丙沙星和恩諾沙星進(jìn)行了SERS光譜探測(cè)，最低檢測(cè)濃度分別為40 ppb、5 ppb、40 ppb。

本文通過(guò)制備高靈敏度的銀溶膠，探測(cè)分析了魚(yú)肉中磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的SERS光譜，確定了提取上述物質(zhì)的最佳提取方法，并計(jì)算了兩者在魚(yú)肉中的檢測(cè)限。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

氫氧化鈉、氨水、硝酸銀、檸檬酸三鈉、鹽酸、硝酸、無(wú)水硫酸鈉等均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水產(chǎn)品中限制使用的兩種磺胺類抗生素(磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶)由上海源葉生物科技有限公司提供；比目魚(yú)購(gòu)自超市；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正己烷來(lái)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；去離子水為中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)學(xué)院自制。所有試劑和藥品均為分析純，使用時(shí)未進(jìn)一步提純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

磁力攪拌器(RCT basic，德國(guó)IKA公司)；超聲清洗器(KQ2200DB，昆山超聲儀器公司)；恒溫干燥箱(DHG-9037A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；微波爐(MM823ESJ-PA，美的集團(tuán)有限公司)；離心機(jī)(TG16-WS，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；掃描電子顯微鏡(S-4800，日本日立公司)

光譜儀為美國(guó)Ocean optics公司生產(chǎn)的新一代QE65Pro便攜式拉曼光譜儀，光柵刻痕密度為900 g/mm，光譜分辨率為10 cm-1。光源采用VA-I-N532固體連續(xù)激光器，激發(fā)波長(zhǎng)為532 nm，激光最大功率為400 mW。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 銀溶膠的制備

將150 mL、0.02%的硝酸銀溶液放入微波爐中加熱[9]。溶液沸騰后，放入熱水浴中，900 r/min攪拌，同時(shí)緩慢加入4 mL、1%的檸檬酸鈉溶液，2 min后放回微波爐中繼續(xù)加熱9 min后取出冷卻至室溫。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置及魚(yú)肉中抗生素的提取

以氨水、乙酸乙酯作為溶劑，分別配置濃度為50 ppm、30 ppm、20 ppm、15 ppm、12 ppm、10 ppm、8 ppm、5 ppm、2 ppm、1 ppm的磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。

為排除魚(yú)肉中脂肪和蛋白質(zhì)等大分子對(duì)光譜的影響，魚(yú)肉中抗生素的提取方法非常重要。主要包括勻漿、離心、去脂、定容這四個(gè)步驟。首先，將1 g魚(yú)肉、1 mL抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液和提取劑混合，勻漿使魚(yú)肉與抗生素充分混合；再將勻漿后的混合物離心取出上清液，向殘?jiān)屑尤胍欢康奶崛?，重?fù)提取一次，合并上清液；進(jìn)一步將上清液水浴蒸發(fā)濃縮至近干，加入一定量的甲醇與正己烷，離心去除正己烷，以去除魚(yú)肉中油脂類物質(zhì)；最后，用提取劑定容至10 mL，得待測(cè)物提取液。 4 ℃保存，用于SERS光譜測(cè)定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論

光譜數(shù)據(jù)分析采用Origin8.1軟件進(jìn)行平滑和去基線處理，光譜探測(cè)時(shí)，到達(dá)樣品的激光功率為50 mW，積分時(shí)間為10 s，每個(gè)樣品探測(cè)五次進(jìn)行平均。

2.1 銀溶膠的表征

經(jīng)微波加熱法制備的銀溶膠顏色為棕綠色，掃描電鏡圖(Scanning election microscope SEM)及紫外可見(jiàn)吸收光譜如圖1所示，可以看出銀納米顆粒是不規(guī)則的球狀，粒徑大小較為均勻，粒徑范圍在45-65 nm之間，吸收峰位于424 nm。

圖1 銀溶膠的掃描電鏡圖及消光光譜Fig.1 Scanning election microscope image and extinction spectrum of silver colloid solution

2.2 魚(yú)肉中抗生素的SERS探測(cè)

2.2.1 磺胺甲基嘧啶與磺胺二甲基嘧啶固體拉曼光譜分析

從分子結(jié)構(gòu)上看，磺胺甲基嘧啶與磺胺二甲基嘧啶只在嘧啶環(huán)上相差一個(gè)甲基，為了分析其拉曼效應(yīng)的異同，取少許磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶固體進(jìn)行拉曼光譜的探測(cè)，圖2為獲得的典型光譜圖。

圖2 典型磺胺類抗生素固體拉曼光譜. (a) 磺胺甲基嘧啶; (b) 磺胺二甲基嘧啶Fig.2 Typical Raman Spectra of solid sulfonamide antibiotics. (a) sulfamerazine; (b) sulfamethazine

通過(guò)對(duì)比兩者的拉曼光譜發(fā)現(xiàn)，其主要特征峰大致相似，分別為：1 636 cm-1(1 644 cm-1)、1 598 cm-1(1 598 cm-1)處的對(duì)位二取代苯環(huán)伸縮振動(dòng)，1 512 cm-1(1 512 cm-1)、1 417 cm-1(1 417 cm-1)處的嘧啶環(huán)伸縮振動(dòng)，1 374 cm-1(1 386 cm-1)的嘧啶環(huán)呼吸振動(dòng)，842 cm-1(838 cm-1)、747 cm-1(719 cm-1)、685 cm-1(686 cm-1)處的對(duì)位二取代苯環(huán)呼吸振動(dòng)。表1列出了磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶主要拉曼峰及其歸屬[10]。從表1可知磺胺甲基嘧啶相比磺胺二甲基嘧啶分別在1 564 cm-1、1 194 cm-1處出現(xiàn)了明顯的拉曼峰，依次代表嘧啶環(huán)的伸縮振動(dòng)、嘧啶環(huán)的呼吸振動(dòng)。分析原因，主要由于兩種物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的差異，磺胺甲基嘧啶結(jié)構(gòu)中嘧啶環(huán)為2,4-雙取代，而磺胺二甲基嘧啶中嘧啶環(huán)為2,4,6-三取代。嘧啶環(huán)中的2,4,6-三取代使得嘧啶環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)稱性更好，影響了嘧啶的拉曼活性，從而影響嘧啶環(huán)的伸縮和呼吸振動(dòng)，導(dǎo)致部分拉曼峰的缺失。

2.2.2 提取劑的確定

由于磺胺類抗生素易溶于部分有機(jī)溶劑和銨鹽溶液，實(shí)驗(yàn)中分別以乙酸乙酯和pH=10的氨水作為抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的溶劑和魚(yú)肉中抗生素的提取劑。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，兩種溶劑配置的磺胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS光譜探測(cè)均具有較好的效果，且氨水作為溶劑時(shí)效果更佳。但在用氨水對(duì)魚(yú)肉中磺胺類抗生素進(jìn)行提取的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)溶液極易變渾濁，而用乙酸乙酯作為提取劑時(shí)得到的提取物溶液無(wú)色透明。圖3 為兩種提取劑的魚(yú)肉中磺胺甲基嘧啶的SERS光譜圖。

圖中顯示，用乙酸乙酯作為提取劑時(shí)，磺胺甲基嘧啶增強(qiáng)效果好，探測(cè)靈敏度高，能夠檢測(cè)到1 605 cm-1、1 551 cm-1、1 342cm-1、1 197 cm-1、1 102 cm-1、734 cm-1處的主要特征峰，相對(duì)于固體拉曼光譜，其峰位有十個(gè)左右波數(shù)的偏移。用氨水作為提取劑時(shí)，受魚(yú)肉中大分子信號(hào)干擾大，對(duì)磺胺甲基嘧啶的探測(cè)效果差，信噪比低，僅能夠探測(cè)到磺胺甲基嘧啶在1 605 cm-1和734 cm-1處微弱的峰。究其原因，可能是因?yàn)榘彼芤号c魚(yú)肉中的大分子蛋白質(zhì)發(fā)生某些反應(yīng)，導(dǎo)致溶液變渾濁，影響了磺胺甲基嘧啶的提取和增強(qiáng)吸附。因此，實(shí)驗(yàn)中均選取乙酸乙酯作為定容溶劑和提取劑。

表1 兩種磺胺類抗生素主要拉曼峰歸屬[10]Tab.1 Raman bands of two kinds of sulfa antibiotics

圖3 兩種提取劑的魚(yú)肉中磺胺甲基嘧啶的SERS光譜圖及銀溶膠溶液和純魚(yú)肉拉曼光譜. (a) 銀溶膠, (b) 純魚(yú)肉, (c，d)為分別采用氨水、乙酸乙酯提取魚(yú)肉中磺胺甲基嘧啶；(e) 磺胺甲基嘧啶固體Fig.3 SERS Spectra of sulfamerazine in different solution extracted from fish and Raman spectrum of gold colloid solution and fish. (a) silver colloid, (b) fish fresh, (c, d) sulfamerazine extracted from fish fresh in ammonia water and ethyl acetate respectively, (e) solid sulfamerazine

2.2.3 魚(yú)肉中磺胺類抗生素的檢測(cè)

以乙酸乙酯作為提取劑，按1.3.2中方法對(duì)魚(yú)肉中的不同濃度的磺胺類抗生素進(jìn)行提取，提取液與銀溶膠1∶1混合，進(jìn)行SERS光譜探測(cè)。圖4為磺胺甲基嘧啶固體拉曼光譜及魚(yú)肉中不同濃度的磺胺甲基嘧啶提取液的SERS光譜。如前所述，相對(duì)于磺胺甲基嘧啶固體的拉曼光譜，提取液中能夠檢測(cè)到1 605 cm-1、1 551 cm-1、1 342 cm-1、1 197 cm-1、1 102 cm-1、734 cm-1的主要特征峰。但相對(duì)于磺胺甲基嘧啶固體的拉曼峰大約有3～15個(gè)波數(shù)的頻移，可能是納米銀顆粒與吸附的磺胺甲基嘧啶發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，從而引起拉曼峰的漂移。當(dāng)濃度為1 ppm時(shí)，在1 605 cm-1和1 102 cm-1處仍還存在微弱的磺胺甲基嘧啶的拉曼特征信號(hào)，因此可檢測(cè)到在魚(yú)肉中的濃度為1 ppm的磺胺甲基嘧啶。

圖4 魚(yú)肉中不同濃度磺胺甲基嘧啶提取液的SERS光譜及銀溶膠溶液和純魚(yú)肉拉曼光譜. (a) 銀溶膠, (b) 純魚(yú)肉提取液, (c, d, e)魚(yú)肉中不同濃度(1 ppm, 5 ppm 和50 ppm)磺胺甲基嘧啶提取液, (f) 磺胺甲基嘧啶固體Fig.4 SERS Spectra of sulfamerazine solution with different concentration extracted from fish and Raman spectrum of gold colloid solution and fish. (a) silver colloid, (b) solution extracted from fish, (c, d, e) sulfamerazine solution with different concentration (1 ppm, 5 ppm and 50 ppm) extracted from fish fresh, (f) solid sulfamerazine

圖5為魚(yú)肉中磺胺甲基嘧啶1 102 cm-1處的特征峰峰強(qiáng)與濃度之間的關(guān)系曲線。可以看出，峰強(qiáng)隨濃度的升高而升高，在低濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。經(jīng)LOD公式計(jì)算[11]，魚(yú)肉中磺胺甲基嘧啶的檢測(cè)限約為0.16 ppm。

圖5 魚(yú)肉中磺胺甲基嘧啶的特征峰強(qiáng)度與濃度變化關(guān)系曲線Fig.5 Dependence of peak intensity of sulfamerazine in fish on Concentration

圖6為磺胺二甲基嘧啶固體及魚(yú)肉中不同濃度的磺胺二甲基嘧啶提取液的SERS光譜。從圖中可知，對(duì)魚(yú)肉中的磺胺二甲基嘧啶進(jìn)行提取后，探測(cè)到的磺胺二甲基嘧啶的拉曼特征峰相對(duì)較少，且在1 601 cm-1、1 024 cm-1、859 cm-1處出現(xiàn)了魚(yú)肉中大分子蛋白質(zhì)的拉曼特征峰。在濃度不低于1 ppm時(shí)可以檢測(cè)到1 134 cm-1處的磺胺二甲基嘧啶的拉曼特征信號(hào)，因此可檢測(cè)到在魚(yú)肉中的濃度為1 ppm的磺胺二甲基嘧啶。

圖6 魚(yú)肉中不同濃度磺胺二甲基嘧啶提取液的SERS光譜及銀溶膠溶液和純魚(yú)肉拉曼光譜. (a) 銀溶膠, (b) 純魚(yú)肉提取液, (c, d, e)魚(yú)肉中不同濃度(1 ppm, 5 ppm, 50 ppm)磺胺二甲基嘧啶提取液, (f) 磺胺二甲基嘧啶固體Fig.6 SERS Spectra of sulfamethazine solution with different concentration extracted from fish and Raman spectrum of gold colloid solution and fish. (a) silver colloid, (b) solution extracted from fish, (c, d, e) sulfamethazine solution with different concentration (1 ppm, 5 ppm and 50 ppm) extracted from fish, (f) solid sulfamethazine

圖7為魚(yú)肉中磺胺二甲基嘧啶在1 134 cm-1處的特征峰強(qiáng)度與濃度變化關(guān)系曲線，由圖中可以看出，在低濃度范圍內(nèi)兩者呈線性關(guān)系，計(jì)算得出魚(yú)肉中磺胺二甲基嘧啶的檢測(cè)限為0.59 ppm。

圖7 魚(yú)肉中磺胺二甲基嘧啶的特征峰強(qiáng)度與濃度變化關(guān)系曲線Fig.7 Dependence of peak intensity of sulfamethazinein fish on Concentration

由2.2.1討論可知，磺胺甲基嘧啶相對(duì)磺胺二甲基嘧啶固體在1 564 cm-1、1 194 cm-1處出現(xiàn)了明顯的拉曼峰。對(duì)比圖4與圖6發(fā)現(xiàn)，魚(yú)肉中抗生素濃度為5 ppm時(shí)，磺胺甲基嘧啶相對(duì)磺胺二甲基嘧啶在1 551 cm-1、1 197 cm-1處依然有明顯的拉曼特征峰，可以據(jù)此差異區(qū)分低濃度時(shí)魚(yú)肉中的磺胺甲基嘧啶與磺胺二甲基嘧啶的存在情況。

3 結(jié)論

本文通過(guò)分析磺胺甲基嘧啶與磺胺二甲基嘧啶固體的分子結(jié)構(gòu)和拉曼光譜，得出了兩者分子結(jié)構(gòu)差異對(duì)拉曼特征信號(hào)的影響。通過(guò)對(duì)魚(yú)肉中磺胺類抗生素提取方法的研究，確定了最佳提取劑和定容溶劑。結(jié)果表明，以銀溶膠為基底，乙酸乙酯作為提取劑和定容溶劑，探測(cè)到魚(yú)肉中磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的最低濃度均為1 ppm，檢測(cè)限分別為0.16 ppm和0.59 ppm，在低濃度范圍內(nèi)特征峰強(qiáng)度與濃度呈線性關(guān)系。研究表明，SERS技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)魚(yú)肉磺胺類抗生素的檢測(cè)，為實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中抗生素的快速檢測(cè)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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