海洋溶菌酶復合保鮮劑抑菌效果的研究

張杰

摘 要：采用抑菌圈法測定海洋溶菌酶、茶多酚及山梨酸鉀對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等菌株的最小抑菌濃度（MIC）并對其抑菌能力進行比較。實驗結(jié)果表明，海洋溶菌酶可有效抑制多數(shù)水產(chǎn)腐敗菌的生長，作為復配劑山梨酸鉀、茶多酚也有各自的抑菌范圍，三者最小抑菌濃度均在允許添加范圍內(nèi)。所以，海洋溶菌酶可以作為保鮮劑用于水產(chǎn)品保鮮。

關(guān)鍵詞：海洋溶菌酶；茶多酚；山梨酸鉀；抑菌圈

溶菌酶，又稱細胞壁水解酶，通過水解細菌細胞壁肽聚糖β-1.4糖苷鍵導致細菌自溶死亡[1-2]。溶菌酶多由蛋清中提取，安全性能高，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的功效，在醫(yī)藥、生物領(lǐng)域得到了廣泛應用，但因其成本過高很難在食品保鮮領(lǐng)域推廣使用。

海洋溶菌酶是一種新型酶制劑，由嗜低溫海洋細菌經(jīng)過發(fā)酵、純化所得[3]。與蛋清溶菌酶相比，海洋溶菌酶不僅具有嗜低溫、抗氧化、抑菌譜廣等優(yōu)點而且生產(chǎn)工藝簡單、成本低廉。本文采用抑菌圈實驗方法分別測定了海洋溶菌酶、茶多酚及山梨酸鉀對水產(chǎn)品中主要腐敗微生物的抑菌效果，為推廣海洋溶菌酶作為生物保鮮劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 保鮮劑 海洋溶菌酶：黃海水產(chǎn)研究所產(chǎn)物資源室保存菌株S-12-86發(fā)酵所得，酶活力25 000 U/mg；茶多酚：安徽石臺茶多酚廠生產(chǎn) 純度>95% （食品級）；山梨酸鉀：南寧赫斯特食品添加劑有限公司 （食品級）。

1.1.2 供試菌種 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腐敗假單胞菌、腐敗希瓦氏菌、嗜水氣單胞菌、乳酸菌、副溶血弧菌。

1.1.3 培養(yǎng)基 細菌、弧菌等營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制。

1.1.4 主要儀器 SW-GJ-IB標準超凈工作臺、恒溫水浴鍋、LDZX-40B型立式自控電熱壓力蒸汽滅菌器、內(nèi)徑90.0 mm平板。

1.2 實驗方法

1.2.1 保鮮劑的制備 采用滅菌蒸餾水將海洋溶菌酶、山梨酸鉀、茶多酚配置成不同濃度備用，具體見表1。

1.2.2 抑菌實驗方法

1.2.2.1 制備菌懸液 將各供試菌種在培養(yǎng)基活化后，無菌操作下挑取菌落2個加入9 mL無菌生理鹽水，使含菌數(shù)在106～107cfu/mL之間。

1.2.2.2 制備含菌平板 將已滅菌的培養(yǎng)基傾注于培養(yǎng)皿中制成平板，用移液管吸取0.2 mL各種菌懸液加入各自平板內(nèi)，再用無菌玻璃涂布棒涂布均勻。

1.2.2.3 測定方法[4] 將直徑為5 mm的濾紙圓片滅菌后在不同濃度保鮮液中浸泡5 min后，取6片濾紙（同一保鮮劑5個濃度梯度和空白對照）貼于含菌平板內(nèi)，每種保鮮液重復三次，然后將平皿倒置于恒溫箱中，培養(yǎng)24 h后用直尺測量各抑菌圈大?。ㄖ睆絤m）。

1.2.3 保鮮劑抑菌性能的測定

1.2.3.1 最小抑菌濃度（MIC） 抑菌圈直徑大于6 mm的各保鮮液最低濃度為最小抑菌濃度。

1.2.3.2 抑菌性能的比較 將抑菌圈直徑在10 mm以上的定為抑菌能力強（+++），8～10 mm定為抑菌能力較強（++），6～8 mm定為抑菌能力弱（+），5 mm為無抑菌能力（-）。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋溶菌酶的抑菌效果

海洋溶菌酶對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等供試菌種的抑制作用見表2。

從表3可以看出，山梨酸鉀對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等菌株無抑制作用，而對枯草芽孢桿菌、乳酸菌有較強的抑制效果，對副溶血弧菌有微弱抑制作用。作為一種酸性防腐劑，山梨酸鉀的防腐能力主要由食品pH值決定。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的適宜pH值偏中性，山梨酸鉀在此環(huán)境中未解離的酸性分子較少，因此抑菌效果受到限制。

水產(chǎn)品的正常pH值在6.50 左右， 且隨著貯藏時間的延長呈上升趨勢。有文獻報道[7]，在pH值3.15時有40%的山梨酸進入細胞內(nèi)部， 而在pH值7.0時解離的山梨酸只有6.0%，由此可知山梨酸鉀在水產(chǎn)品保鮮中抑菌能力隨著貯藏時間的延長而減弱。

2.3 茶多酚的抑菌效果

茶多酚對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等供試菌種的抑制作用見表4。

從表4可以看出，茶多酚對金黃色葡萄球菌、腐敗假單胞菌和大腸桿菌有較強的抑制作用，濃度越高其抑菌效果越強。茶多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和腐敗假單胞菌的最小抑菌濃度分別為800 mg/kg、800 mg/kg和1 500 mg/kg，均在水產(chǎn)品中允許最高添加量3 000 mg/kg以下，這與董金甫[8]和楊聯(lián)松報道的茶多酚的最小抑菌濃度低于3 000 mg/kg相符合的。

2.4 抑菌能力比較

海洋溶菌酶及復配劑對腐敗菌抑菌能力比較和最小抑菌濃度見表5、表6。

表5表明，海洋溶菌酶對多數(shù)水產(chǎn)腐敗菌有較強的抑制效果，山梨酸鉀、茶多酚作為復配劑可有效彌補海洋溶菌酶的不足。將其復配使用，不僅可以增強抑菌、抗氧化效果，而且可以減少對食品感官品質(zhì)的影響[9]。表6實驗結(jié)果表明，海洋溶菌酶、山梨酸鉀和茶多酚對水產(chǎn)腐敗菌的最小抑菌濃度（MIC）分別為4 000、400、1 500 mg/L，均在各自允許添加范圍內(nèi)；海洋溶菌酶、茶多酚均對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有很強的抑制效果，但海洋溶菌酶價格低廉，實際應用中可降低復合保鮮劑中茶多酚的用量。

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，海洋溶菌酶對除腐敗希瓦氏菌、嗜水氣單胞菌以外的微生物均有非常明顯的抑菌作用，山梨酸鉀通過

破壞細菌的重要酶系來抑制需氧性和pH值偏低的微生物，而茶多酚更是兼具有良好的抗氧化效果。海洋溶菌酶作為一種蛋白質(zhì)與山梨酸鉀、茶多酚具有良好的相容性，所以復合保鮮劑可安全地用于水產(chǎn)品保鮮。

海洋溶菌酶作為一種新型酶制劑已工業(yè)化生產(chǎn)且價格低廉，本文嘗試將其用于水產(chǎn)保鮮取得一定效果，希望有更多的學者將其開發(fā)用于肉制品、果蔬保鮮中，使其成為一種新型生物保鮮劑。

參考文獻：

[1] Sun DAO-PIN，DER-ING LIAO，STEPHEN J.REMINGTON. Electrostatic field in the active sites of lysozymes. Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86：5361-5365

[2] Hisham R I，Tetsuji M，Takayoshi A. Genetic evidence that antibacterial activity of lysozyme is independent of its catalytic function. FEBS Letts，2001，506：27-32

[3] 張琇，王躍軍，孫謐，等.海洋細菌S-12-86的產(chǎn)溶菌酶條件.中國水產(chǎn)科學，2007，14（3）： 425-429

[4] 馬麗珍.冷卻豬肉的生物和物理綜合保鮮技術(shù)及保鮮機理研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文，2003.6

[5] 楊向科，鄒艷麗，孫謐，等.海洋微生物溶菌酶的抑菌作用及抑菌機理初步研究.海洋水產(chǎn)研究，2005，26（5）：62-68

[6] Pelligrini，A.，Thomas，U.，Wild，P.et al.1992.Bactericidal activities of lysozyme and aprotinin against gram-negative and gram-positive bacteria related to their basic character.J.Applied Bacteriology，72（3）：180-187

[7] 張嫚. 冷卻牛肉保鮮技術(shù)研究[M].南京：南京農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文，2003.6

[8] 董金甫，李瑤卿，洪紹梅.茶多酚對8種致病菌最低抑制濃度的研究[J].食品科學，1995，16（1）：6-12

[9] 于開亮，李開雄，盧士玲. Nisin、茶多酚、殼聚糖復合保鮮冷卻羊肉的配比優(yōu)化研究.肉類工業(yè)，2007（12）：27-30

海洋溶菌酶作為一種新型酶制劑已工業(yè)化生產(chǎn)且價格低廉，本文嘗試將其用于水產(chǎn)保鮮取得一定效果，希望有更多的學者將其開發(fā)用于肉制品、果蔬保鮮中，使其成為一種新型生物保鮮劑。

參考文獻：

[1] Sun DAO-PIN，DER-ING LIAO，STEPHEN J.REMINGTON. Electrostatic field in the active sites of lysozymes. Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86：5361-5365

[2] Hisham R I，Tetsuji M，Takayoshi A. Genetic evidence that antibacterial activity of lysozyme is independent of its catalytic function. FEBS Letts，2001，506：27-32

[3] 張琇，王躍軍，孫謐，等.海洋細菌S-12-86的產(chǎn)溶菌酶條件.中國水產(chǎn)科學，2007，14（3）： 425-429

[4] 馬麗珍.冷卻豬肉的生物和物理綜合保鮮技術(shù)及保鮮機理研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文，2003.6

[5] 楊向科，鄒艷麗，孫謐，等.海洋微生物溶菌酶的抑菌作用及抑菌機理初步研究.海洋水產(chǎn)研究，2005，26（5）：62-68

[6] Pelligrini，A.，Thomas，U.，Wild，P.et al.1992.Bactericidal activities of lysozyme and aprotinin against gram-negative and gram-positive bacteria related to their basic character.J.Applied Bacteriology，72（3）：180-187

[7] 張嫚. 冷卻牛肉保鮮技術(shù)研究[M].南京：南京農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文，2003.6

[8] 董金甫，李瑤卿，洪紹梅.茶多酚對8種致病菌最低抑制濃度的研究[J].食品科學，1995，16（1）：6-12

[9] 于開亮，李開雄，盧士玲. Nisin、茶多酚、殼聚糖復合保鮮冷卻羊肉的配比優(yōu)化研究.肉類工業(yè)，2007（12）：27-30

海洋溶菌酶作為一種新型酶制劑已工業(yè)化生產(chǎn)且價格低廉，本文嘗試將其用于水產(chǎn)保鮮取得一定效果，希望有更多的學者將其開發(fā)用于肉制品、果蔬保鮮中，使其成為一種新型生物保鮮劑。

參考文獻：

[1] Sun DAO-PIN，DER-ING LIAO，STEPHEN J.REMINGTON. Electrostatic field in the active sites of lysozymes. Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86：5361-5365

[2] Hisham R I，Tetsuji M，Takayoshi A. Genetic evidence that antibacterial activity of lysozyme is independent of its catalytic function. FEBS Letts，2001，506：27-32

[3] 張琇，王躍軍，孫謐，等.海洋細菌S-12-86的產(chǎn)溶菌酶條件.中國水產(chǎn)科學，2007，14（3）： 425-429

[4] 馬麗珍.冷卻豬肉的生物和物理綜合保鮮技術(shù)及保鮮機理研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學博士學位論文，2003.6

[5] 楊向科，鄒艷麗，孫謐，等.海洋微生物溶菌酶的抑菌作用及抑菌機理初步研究.海洋水產(chǎn)研究，2005，26（5）：62-68

[6] Pelligrini，A.，Thomas，U.，Wild，P.et al.1992.Bactericidal activities of lysozyme and aprotinin against gram-negative and gram-positive bacteria related to their basic character.J.Applied Bacteriology，72（3）：180-187

[7] 張嫚. 冷卻牛肉保鮮技術(shù)研究[M].南京：南京農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文，2003.6

[8] 董金甫，李瑤卿，洪紹梅.茶多酚對8種致病菌最低抑制濃度的研究[J].食品科學，1995，16（1）：6-12

[9] 于開亮，李開雄，盧士玲. Nisin、茶多酚、殼聚糖復合保鮮冷卻羊肉的配比優(yōu)化研究.肉類工業(yè)，2007（12）：27-30