時(shí)間分辨免疫熒光法用于梅毒抗體測(cè)定的探討

廖 群,劉小玲,郭 惠

(重慶市急救醫(yī)療中心 檢驗(yàn)科,重慶400014)

梅毒螺旋體屬于密螺旋體屬蒼白螺旋體中的蒼白亞種[1]，是由梅毒螺旋體引起的一種慢性的，系統(tǒng)的傳染性疾病，對(duì)健康危害程度僅次于艾滋病，幾乎可以累及全身各個(gè)器官，導(dǎo)致功能障礙。梅毒的傳播途徑大多數(shù)通過性接觸傳播亦通過血液和垂直傳播，是傳染性極強(qiáng)的疾病，近年來梅毒在我國(guó)的發(fā)病率明顯增大，其流行對(duì)人類的健康形成了嚴(yán)重威脅，也給社會(huì)造成了巨大壓力。梅毒的早期診斷與防治也成為十分重要的社會(huì)和醫(yī)學(xué)問題。2004年12月1日起施行的傳染病防治法中將梅毒列為乙類傳染病，梅毒的相關(guān)血清學(xué)檢驗(yàn)是目前規(guī)定的手術(shù)、輸血(供、受血者)及各種創(chuàng)傷性檢查的患者必須進(jìn)行的檢測(cè)項(xiàng)目之一[2]。目前血清學(xué)試驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)室診斷梅毒的主要方法，在梅毒的診治及研究方面均有重要意義。選擇有效的檢測(cè)方法對(duì)梅毒早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療及正確評(píng)價(jià)疾病、控制疾病的蔓延有著重大意義。

臨床上血清試驗(yàn)主要分為兩大類：一類為非TP抗原血清學(xué)試驗(yàn)如RPR、TRUST等，主要檢測(cè)梅毒患者血清中非特異性的類脂質(zhì)抗體；另一類為TP抗原血清學(xué)試驗(yàn)如TPPA，還有ELISA、金標(biāo)法等。長(zhǎng)期以來國(guó)內(nèi)外都在不斷探討更靈敏的梅毒血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，近年來時(shí)間分辨熒光分析法(TRFIA)的應(yīng)用使梅毒抗體的檢測(cè)上了一個(gè)新臺(tái)階。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用時(shí)間分辨熒光分析法與傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法TPPA、TP-ELISA比較，探討其在梅毒血清學(xué)診斷中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1樣本來源血清標(biāo)本選擇來自本院2012年1月至2012年7月門診患者共計(jì)256份。采集靜脈血及時(shí)離心分離血清，置-20℃冷凍保存；2NICU及1NICU的梅毒質(zhì)控血清由康徹斯坦提供。

1.2試劑TRFIA試劑盒由蘇州新波生物技術(shù)有限公司提供，試劑批號(hào)2012052001；ELISA試劑盒由北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)為N20121016；TPPA試劑盒由日本富士瑞比歐公司提供，批號(hào)VN30203。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3儀器芬蘭MK3酶標(biāo)儀，恒溫水浴箱，新波洗板機(jī)，新波EFFICUTA全自動(dòng)樣本前處理系統(tǒng)，新波ANYTST2000時(shí)間分辨熒光分析儀。

1.4檢測(cè)原理TRFIA：用基因重組抗原包被酶標(biāo)板孔，與待檢血清反應(yīng)后加入銪標(biāo)記抗原，若存在梅毒抗體則可檢測(cè)到熒光信號(hào)，熒光值與抗體含量呈正比；TPPA：用經(jīng)裂解的梅毒螺旋體為抗原，致敏經(jīng)醛化，鞣化的羊或禽類紅細(xì)胞，該紅細(xì)胞可與待檢樣本中的梅毒螺旋體抗體結(jié)合而出現(xiàn)凝集反應(yīng)；ELISA：采用雙抗原夾心法，利用辣根過氧化酶和底物的結(jié)合后顏色變化，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測(cè)。

1.5方法

1.5.1 靈敏度、特異性測(cè)試 將256份標(biāo)本分別用TRFIA、ELISA、TPPA三種方法進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.5.2 精密度檢測(cè) 將高濃度病人標(biāo)本混合稀釋配成高中低三個(gè)梯度標(biāo)本用TRFIA法進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，批內(nèi)精密度：用三個(gè)濃度標(biāo)本重復(fù)測(cè)定20次。批間精密度：三個(gè)濃度標(biāo)本每天測(cè)定一次，分別測(cè)20天，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5.3 線性試驗(yàn) 將不同濃度(1NICU、2 NICU)質(zhì)控品分別作1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32倍稀釋，用TRFIA法進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.4 P50檢測(cè) 將質(zhì)控標(biāo)本一系列稀釋，用TRFIA法重復(fù)測(cè)定以確認(rèn)獲得50%陽(yáng)性及50%陰性結(jié)果的稀釋度。

1.5.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 診斷評(píng)價(jià)指標(biāo)分析 以TPPA試驗(yàn)為對(duì)照，對(duì)256份標(biāo)本分別用TPPA，ELISA、TRFIA三種方法測(cè)定TP結(jié)果，計(jì)算靈敏度、特異性和結(jié)果符合率見表1。

表1 256例標(biāo)本用三種方法測(cè)定TP結(jié)果比較

根據(jù)表1數(shù)據(jù)得出TRFIA與TPPA相比其靈敏度為100%，特異性為98.2%，符合率為98.4%。ELISA與TPPA相比其靈敏度為97%，特異性為94%，符合率為94.5%。

2.2 差異性檢驗(yàn) 分別將TRFIA、ELISA法測(cè)TP特異性抗體的結(jié)果以TPPA檢驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，分類進(jìn)行兩兩χ2檢驗(yàn)，以判斷兩種方法的差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表2。

表2 配對(duì)χ2檢驗(yàn)結(jié)果

由表2可得：TPPA和TRFIA、ELISA方法測(cè)定梅毒特異性抗體無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 Kappa一致性檢驗(yàn) 用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 不同檢測(cè)方法間Kappa一致性檢驗(yàn)結(jié)果

僅僅用Kappa來判斷兩種方法的一致性是不夠的，還需要進(jìn)一步用假設(shè)檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。只有在假設(shè)檢驗(yàn)判斷具有一致性的基礎(chǔ)上評(píng)價(jià)一致性強(qiáng)度才有意義。不同檢測(cè)方法間假設(shè)檢驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 不同檢測(cè)方法間假設(shè)檢驗(yàn)結(jié)果

通過假設(shè)檢驗(yàn)結(jié)果判斷：TRFIA法測(cè)TP特異性抗體與TPPA方法檢測(cè)結(jié)果一致，ELISA法測(cè)TP特異性抗體與TPPA方法檢測(cè)結(jié)果一致，但TRFIA法Kappa為0.93>0.75，表明與TPPA方法相比一致性優(yōu)。ELISA法Kappa為0.72<0.75，表明與TPPA方法相比一致性一般。

2.4 結(jié)果的精密度 高中低三種濃度標(biāo)本測(cè)定TP的批內(nèi)、批間精密度結(jié)果見表5。

表5 TRFIA法的批內(nèi)、批間精密度結(jié)果(n=20)

批內(nèi)、批間精密度均<10%,表明精密度高、重復(fù)性好

2.5 線性試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果 質(zhì)控1NCU、2NCU系列稀釋濃度值的變化結(jié)果見表6。

表6 TRFIA法測(cè)TP的1NICU、2NICU系列稀釋度、

注：△相關(guān)系數(shù)r=0.95，回歸方程y=0.1761x+0.0164,▲相關(guān)系數(shù)r=0.999，回歸方程y=0.237x-0.0909。相關(guān)系數(shù)均>0.9，說明相關(guān)性高

2.6 臨界濃度的檢測(cè) 將1NCU的質(zhì)控品系列稀釋，在0.12NCU處用40份重復(fù)測(cè)定得到45%的陽(yáng)性結(jié)果，55%的陰性結(jié)果。則判斷該濃度為臨界濃度P50。0.15NCU為最低檢出濃度P95，0.1NCU為P5。

3 討論

目前檢測(cè)梅毒血清學(xué)試驗(yàn)的方法很多，其特異性、靈敏度、臨床價(jià)值有所不同[3-7]。TRFIA、TPPA、ELISA法均檢測(cè)的是梅毒IgM、IgG混合抗體，早期的IgM抗體和恢復(fù)期產(chǎn)生的IgG抗體均會(huì)使檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。筆者通過對(duì)2012年1月至2012年7月我院256名門診患者(主要來自于皮膚研究所、婦產(chǎn)科)的梅毒血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)TP-ELISA法檢測(cè)陽(yáng)性率為18.7%，與文獻(xiàn)報(bào)道接近[8]。通過ELISA、TPPA、TRFIA三種方法對(duì)256例血清標(biāo)本進(jìn)行TP檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，ELISA方法檢測(cè)有48例陽(yáng)性，陽(yáng)性率18.7%，TRFIA法39例陽(yáng)性，陽(yáng)性率15.2%，而金標(biāo)準(zhǔn)TPPA僅有35例陽(yáng)性，陽(yáng)性率13.67%。由此可見與TRFIA、TPPA相比，ELISA測(cè)定TP假陽(yáng)性率相對(duì)較高，ELISA影響因素較多，如標(biāo)本中一些血漿蛋白紊亂，類過氧化物酶樣物質(zhì)的增高等均可造成假陽(yáng)性。由于酶免疫法酶的抗干擾和靈敏度上比時(shí)間分辨法抗干擾的能力稍弱，容易受環(huán)境和血液是否溶血、黃疸等因素影響，而致假陽(yáng)性情況出現(xiàn)，對(duì)臨床診斷有一定的誤導(dǎo)。TRFIA采用基因重組抗原包被酶標(biāo)板孔，與待檢血清反應(yīng)后加入銪標(biāo)記抗原，若存在梅毒抗體則可檢測(cè)到熒光信號(hào)，熒光值與抗體含量呈正比。由于采用震蕩反應(yīng)并適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間更有助于提高靈敏度，降低本底[9]。本文結(jié)果表明TRFIA法最低檢測(cè)濃度為0.15NCU。TRFIA分析系統(tǒng)采用波長(zhǎng)分辨、時(shí)間分辨和1000次均值等方法，提高了系統(tǒng)的靈敏度和特異性，真正實(shí)現(xiàn)了零本底測(cè)量提高了檢測(cè)精度[10-11]。與經(jīng)公認(rèn)的梅毒血清確證試驗(yàn)[12]TPPA法相比，TRFIA特異性98.2%，靈敏度100%，符合率98.4%,Kappa值0.936，說明TRFIA法具有較高的靈敏度和特異性，與TPPA法相比有很高的一致性。時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù)具有重復(fù)性好，批內(nèi)變異<8%,批間變異<15%表明其精密度、穩(wěn)定性好。而采用時(shí)間分辨熒光分析法全自動(dòng)樣本前處理系統(tǒng)EFFICUTA進(jìn)行自動(dòng)加樣，可避免造成人為的誤差。ELISA與TPPA相比其靈敏度為97%，特異性為94%，符合率為94.5%。ELISA法Kappa為0.72<0.75，表明與TPPA方法相比一致性一般。

時(shí)間分辨法可克服酶免和TPPA試劑在環(huán)境和血液狀態(tài)的干擾。雖然有大量資料[13，16]顯示ELISA方法敏感性、特異性都較高，但與TRFIA相比，TRFIA的靈敏度、特異性均高于ELISA法。因此TRFIA更適合作為梅毒的初篩實(shí)驗(yàn)。雖然ELISA方法也是檢測(cè)的梅毒特異性抗體，且操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用酶標(biāo)儀進(jìn)行結(jié)果判斷，客觀準(zhǔn)確，原始資料也容易保存，是目前臨床普遍用于梅毒大批量篩查的方法，由于目前國(guó)內(nèi)各試劑廠家采用的基因重組抗原不同，免疫組份的表達(dá)抗原組合含有一些非特異性反應(yīng)物質(zhì)使ELISA法存在難以回避的一些致假陽(yáng)性因素。某些與人類共生的螺旋體也可與ELISA試劑盒中包被的抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，使標(biāo)本中的一些類過氧化物酶樣物質(zhì)的增高和血漿中的蛋白紊亂等引起假陽(yáng)性結(jié)果。TPPA法是目前普遍采用的梅毒抗體確證試驗(yàn)，但試劑成本較高，檢測(cè)時(shí)需將標(biāo)本作系列稀釋，不利于大批量標(biāo)本檢測(cè)。TPPA試劑的致敏顆粒溶解后，保存時(shí)間較短，約為5天左右，放置時(shí)間較長(zhǎng)后，吸附在致敏顆粒上的抗原性物質(zhì)易脫落而致假陰性的出現(xiàn)，以及出現(xiàn)溶血和黃疸現(xiàn)象時(shí)，很難通過肉眼觀察是否發(fā)生凝集，且以肉眼判斷結(jié)果，原始數(shù)據(jù)無法保存。不適用大批樣本篩查。時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)具有重復(fù)性好，標(biāo)記物存儲(chǔ)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[17]，在高、中、低濃度的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于10%，提示系統(tǒng)精密度高。在線性試驗(yàn)時(shí)1NICU和2NICU系列稀釋后測(cè)定結(jié)果表現(xiàn)出了較高的線性相關(guān)，分別為0.999和0.95，表明相關(guān)系數(shù)、回歸方程均表現(xiàn)出良好等線性。與金標(biāo)準(zhǔn)TPPA相比，靈敏度為100%，特異性為98.2%，符合率為98.4%，表明兩者相關(guān)性好。兩者比較P>0.05,Kappa值為0.93，說明TPPA和TRFIA兩種方法測(cè)定梅毒特異性抗體結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，一致性好。而其最低檢測(cè)濃度為0.15NCU，降低了假陰性的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，用時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測(cè)梅毒非特異性抗體具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、所用試劑有良好的穩(wěn)定性、檢測(cè)限較寬、檢測(cè)能力強(qiáng)，與TPPA相關(guān)性好。尤其是能消除常規(guī)熒光測(cè)定中的高背景等優(yōu)點(diǎn)，是非放射免疫分析中很有發(fā)展?jié)摿Φ姆治龇椒?。全自?dòng)樣本前處理系統(tǒng)EFFICUTA進(jìn)行加樣自動(dòng)加樣，避免了人為誤差，是穩(wěn)定可靠地常規(guī)特異性梅毒抗體檢測(cè)方法，采用計(jì)算機(jī)控制自動(dòng)化操作系統(tǒng)，結(jié)果判定準(zhǔn)確、原始數(shù)據(jù)容易保存等優(yōu)點(diǎn)。與TPPA是彼此確認(rèn)和復(fù)核的最佳選擇。尤其適合臨床進(jìn)行大批量的篩查實(shí)驗(yàn)。

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