基因芯片技術(shù)檢測結(jié)核桿菌耐藥的臨床研究

孫炳奇，張 娟，孫 嬌，孫秀華，赫心劍

(1.沈陽市胸科醫(yī)院 結(jié)核病實驗室，遼寧 沈陽110044；2.中國醫(yī)科大學(xué) 生物科學(xué)與生物技術(shù)系97K41B，遼寧 沈陽110001)

近年來，結(jié)核分枝桿菌的耐藥問題已成為全球關(guān)注的熱點問題[1-3]，也是我國結(jié)核病防治工作中面臨的挑戰(zhàn)之一。長期以來，我國結(jié)核病實驗室通常采用絕對濃度法或比例法進行結(jié)核桿菌藥敏試驗，這些方法盡管具有簡單、經(jīng)濟等優(yōu)勢，但耗時較久，操作復(fù)雜，且結(jié)果不穩(wěn)定，可重復(fù)性差，遠不能滿足臨床診治的需要。伴隨著結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機制的闡明，通過檢測耐藥基因突變快速診斷耐藥結(jié)核病的技術(shù)日益受到重視[4-6]。本研究采用基因芯片技術(shù)分別檢測異煙肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampicin，RFP)的耐藥情況，并與傳統(tǒng)羅氏藥敏結(jié)果進行對比，探討其在藥敏檢測中的臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1樣本與試劑選取羅氏培養(yǎng)生長陽性菌株38例，包括8例INH和RPF均敏感菌株，18例耐多藥菌株(INH和RFP均耐藥)，6例單耐INH和6例單耐RFP菌株。晶芯 ExtractorTM核酸快速提取儀、PCR擴增儀、結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測試劑盒(芯片法)、晶芯Biomixer芯片雜交儀、晶芯 SlideWasherTM芯片洗干儀和晶芯 LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀均由博奧生物有限公司生產(chǎn)。本研究已經(jīng)過沈陽市胸科醫(yī)院倫理委員會通過。

1.2羅氏藥敏試驗通過觀察改良羅氏培養(yǎng)基上結(jié)核分枝桿菌菌落的生長速度、色澤等生物學(xué)性狀，選取適當(dāng)?shù)木?，按照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[7]，挑取培養(yǎng)基上菌落，用無菌0.5% 吐溫80生理鹽水溶解、稀釋。與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷幔粗瞥? g/L菌懸液，10倍稀釋(連續(xù)兩次)至10-2g/L，用滅菌吸管準(zhǔn)確吸取0.1 ml菌液分別接種至對照及含藥培養(yǎng)基斜面，每管接種量為10-3mg。異煙肼和利福平藥物濃度分低高兩種濃度，分別是0.2 mg/L、1 mg/L；50 mg/L、250 mg/L。

1.3樣本制備及核酸提取取羅氏培養(yǎng)基上生長的結(jié)核分枝桿菌，用22SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)收集細(xì)菌1環(huán)，并懸在250 μl 結(jié)核桿菌DNA提取液中。封口膜封口，99℃加熱20 min，14 000 rpm離心10 min，轉(zhuǎn)移上清到新的1.5 ml離心管，上清即為DNA模板。

1.4基因芯片技術(shù)檢測向每管中分別加入同一樣品的PCR對照產(chǎn)物和耐藥基因擴增產(chǎn)物，并將混合物加熱至95℃變性5 min，之后立即浸入冰水混合物中冰浴3 min。經(jīng)蓋片的加樣孔加入13.5 μl雜交反應(yīng)混合物，迅速蓋上雜交盒并密封，每個微陣列限加一份相應(yīng)的雜交反應(yīng)混合物，然后放入晶芯Biomixer芯片雜交儀進行芯片反應(yīng)，再將完成雜交的芯片放入晶芯SlideWasherTM芯片洗干儀中進行洗干，將洗干的芯片載入晶芯LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀中，自動進行結(jié)果判讀。

1.5 與羅氏藥敏結(jié)果不符的標(biāo)本均進行測序驗證，測序引物分別為INH-ahpC-seq-F:5'-CTTGCCGGAAAGACATGCC-3'，INH-ahpC-seq-R:5'-CGTCACTGGTGATAGTGGTG A-3'；INH-inhA-seq-F:5'-AGCGCGACATACCTGCTG-3'，INH-inhA-seq-R:5'-CCG ATCCC CCGGTTTCC-3'；INH-inhA94-seq-F:5'-CGTTTC ACATCGCACGGG-3'，INH-inhA94-seq- R:5'-GGCTCGGGTCGAAGTC-C-3'；INH-katG-seq-F:5'-CGAGACGTTTCGGCGC-3'，INH-katG-seq-R:5'-CCGTCCTTGGCGGTGT-3'；RFP-seq-F:5'-CGGGAGCGGATGACC AC-3'，RFP-seq-R:5'-GCG GTACGGCGTTTCGA-

T-3'。測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩種方法檢測結(jié)果的差異性應(yīng)用配對四格表卡方檢驗判別(α=0.05)，兩種方法檢測結(jié)果的一致性用Kappa檢驗判別(Kappa≥0.75，兩者一致性較好；0.75>Kappa≥0.4，兩者一致性一般；Kappa<0.4，兩者一致性較差)。

2 結(jié)果

羅氏培養(yǎng)藥物敏感實驗中只要低濃度管中結(jié)核桿菌生長即為對該種藥物耐藥。對INH檢測的38例菌株中，32例與羅氏結(jié)果相符，總符合率84.2%，敏感度和特異度分別是75.0%和100.0%，兩種方法無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(P>0.05)，Kappa值為0.69，兩種方法一致性一般；38例對RFP檢測結(jié)果中，34例與羅氏結(jié)果相符，總符合率為89.5%，敏感度和特異度分別是91.7%和85.7%，兩種方法無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(P>0.05)，Kappa值為0.77，兩種方法一致性較好。見表1和表2。

表1 基因芯片技術(shù)對異煙肼和利福平藥物敏感性

表2 基因芯片檢測耐藥的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和к值

3 討論

近年來，結(jié)核分枝桿菌耐藥性呈逐年上升趨勢[8]，異煙肼和利福平作為抗結(jié)核一線藥物，其耐藥性檢測對于臨床結(jié)核病藥物治療具有重要意義[9]。分子診斷技術(shù)是近年來開發(fā)運用于結(jié)核病耐藥基因的熱點技術(shù)[10，11]，可以通過檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的位點突變來預(yù)測表型耐藥，從而快速準(zhǔn)確地檢測結(jié)核桿菌耐藥性?；蛐酒夹g(shù)作為一種高通量自動化檢測技術(shù)，在病原微生物分子診斷方面可用于病原體菌種鑒定、分型、鑒別、診斷、耐藥性檢測等多個領(lǐng)域，具有快速、準(zhǔn)確、高通量、自動化程度高等優(yōu)點，成為近年來研究的熱點。本研究將其用于異煙肼和利福平耐藥檢測，結(jié)果顯示與羅氏培養(yǎng)結(jié)果的符合率分別為84.2%和89.5%，敏感度為75.0%和91.7%，特異度為100.0%和85.7%。此方法與羅氏藥敏檢測結(jié)果一致性較好，并且操作簡便，檢測快速，符合臨床的需要，雖然受限于其自身耐藥基因突變的特點而無法檢出所有的耐藥結(jié)核分枝桿菌，但對于快速篩查結(jié)核分枝桿菌耐藥突變以及制定相應(yīng)的治療方案，從而降低耐藥菌株在人群中的傳播均有十分積極的意義。

本研究應(yīng)用基因芯片方法對38例樣本進行異煙肼耐藥基因突變檢測中，同羅氏藥物敏感試驗相比共有6例檢測結(jié)果不同，均為羅氏藥物敏感試驗結(jié)果為耐藥而基因芯片檢測結(jié)果為敏感，這可能與基因芯片檢測位點有限(檢測katG和InhA基因相關(guān)位點)，未能涵蓋所有引起耐藥的突變位點有關(guān)。而基因芯片對38例菌株利福平耐藥性的檢測結(jié)果有4例與羅氏不同，其中2例為羅氏藥物敏感試驗結(jié)果為耐藥而基因芯片檢測結(jié)果為敏感，可能與基因芯片RFP檢測位點外其它位點的突變從而引起耐藥有關(guān)；另2例為羅氏藥物敏感試驗結(jié)果為敏感而基因芯片檢測結(jié)果為耐藥，后經(jīng)測序證明為突變菌株，考慮可能系耐藥基因出現(xiàn)無義突變，造成分子生物學(xué)診斷與表型耐藥結(jié)果不一致；也有可能與羅氏藥敏培養(yǎng)基中藥物經(jīng)加熱后造成藥物活性下降有關(guān)。

在檢測RFP耐藥試驗中，基因芯片與羅氏藥物敏感試驗兩種方法的一致性較好(Kappa值0.77)；在檢測INH耐藥試驗中，基因芯片與羅氏藥物敏感試驗兩種方法的一致性一般(Kappa值0.69)。這與文獻報道中， KatG和InhA基因位點突變引起的INH耐藥只占總INH耐藥的70%，而rpoB基因位點突變引起的RFP耐藥占總RFP耐藥的90%是一致的。另外，在INH和RFP耐藥檢測中，在兩種方法均無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。

與傳統(tǒng)藥敏試驗相比，基因芯片技術(shù)在應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥的快速檢測時有較高的陽性檢出能力，有著良好的特異度和靈敏度，同時更加簡便、快速，能為臨床耐藥結(jié)核病的篩查與防治提供良好的技術(shù)支持[12]，對臨床及時準(zhǔn)確進行抗結(jié)核治療具有重要意義。但是分子生物學(xué)檢測手段多需要特殊儀器及相關(guān)的軟件分析系統(tǒng)，檢測成本較高，這也在一定程度上限制了其在基層醫(yī)院的推廣應(yīng)用。

作者簡介：孫炳奇(1976-)，男，碩士，副主任檢驗師，主要從事結(jié)核菌快速檢測和耐藥機制的研究工作。

參考文獻：

[1]Yu CC，Chang CY，Liu CE ，et al.Drug resistance pat tern of Mycobacterium tuberculosis complex at a medical center in central Taiwan[J].Microbiol Immunol Infect，2010，43(4):285.

[2]Gumbo T.New susceptibility breakpoint s for first line antituberculosis drugs based on antimicrobial pharmacokinetic/pharmacodynamic science and population pharmacokinetic variability[J].Antimicrob Agents Chemother，2010，54(4):1484.

[3]Li GL，Zhao DF，Xie T，et al.Molecular characterization of drug-resistant Beijing family isolates of Mycobacterium tuberculosis f rom Tianjin，China [J].Biomed Environ Sci，2010，23(3):188.

[4]Kim SY，Park YJ，Song E，et al．Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis[J]．Diagn Microbiol Infect Dis，2006，54:203.

[5]Park H，Song EJ，Song ES，et al．Comparison of a conventional antimicrobial susceptibility assay to an oligonucleotide chip system for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates[J]．Clin Microbiol，2006，44:1619.

[6]Guo Y，Zhou Y，Wang C，et al．Rapid，accurate determination of multidrug resistance in M．tuberculosis isolates and sputum using a biochip system[J]．Int Tuberc Lung Dis，2009，13:914.

[7]中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會.結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程[M].北京：中國教育文化出版社,2006;54,56-57.

[8]Hu Y，Hoffner S，Jiang W，et al.Genetic characterisation of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis in rural China:a population2based study[J].Int Tuberc Lung Dis，2010，14(2):210.

[9]Cade CE，Dlouhy AC，Medzihradszky KF，et al.Isoniazid-resistance conferring mutations in Mycobacterium tuberculosis Kat G:catalase，peroxidase，and INH-NADH adduct formation activities[J].Protein Sci,2010，19(3):458.

[10]Bravo LT，Tuohy MJ，Ang C，et al.Pyrosequencing for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis resistance to rifampin，isoniazid，and fluoroquinolones[J].Clin Microbiol，2009，47:3985.

[11]Pietzka AT，Indra A，Stoger A，et al.Rapid identification of multigrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates by rpoB gene scanning using high-resolution melting curve PCR analysis[J].Antimicrob Chemother[J]，2009，63:1121.

[12]張立群，王云霞，周 敏,等.4種不同結(jié)核分枝桿菌檢測方法對結(jié)核病的診斷價值比較[J]．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志 2010,11:1633.