尉鴻飛,牟曉東,朱元祺,馬金龍,趙靜宜*,劉新利
(1.齊魯工業(yè)大學(xué) 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南250353;2.中國(guó)石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院 生物工程與技術(shù)中心,山東 青島266580;3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科,山東 青島266003)
大腸埃希菌是臨床腸桿菌科細(xì)菌中常見(jiàn)的機(jī)會(huì)致病菌,頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥物是兩種臨床應(yīng)用最廣泛的抗生素,過(guò)度使用導(dǎo)致了耐藥菌的逐漸增加。國(guó)內(nèi)傳播最廣泛的頭孢菌素耐藥基因是blaCTX-M,該基因常常位于可移動(dòng)質(zhì)粒上,造成頭孢菌素耐藥性在不同細(xì)菌間水平傳播。細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性包括染色體編碼的垂直耐藥性和質(zhì)粒介導(dǎo)的傳播耐藥性兩種機(jī)制。由于質(zhì)粒能夠加速耐藥基因在臨床病原菌中的傳播,因而,質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥性(plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)在近十年中引起了全球關(guān)注。迄今PMQR已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了三種機(jī)制:qnr基因編碼的靶酶保護(hù)機(jī)制,aac(6’)-Ib-cr基因編碼的藥物失活機(jī)制,qepA和oqxAB基因編碼的藥物外排機(jī)制。這三種機(jī)制已經(jīng)在世界范圍30多個(gè)國(guó)家的臨床和環(huán)境分離腸桿菌中檢測(cè)到[1]。
前期研究發(fā)現(xiàn),許多臨床分離的大腸埃希菌可對(duì)頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥物同時(shí)耐藥,多種PMQR基因與bla基因組合在菌株中被檢測(cè)到[2],這將促進(jìn)臨床病原菌多重耐藥性的產(chǎn)生,進(jìn)而加劇細(xì)菌感染控制和治療的難度。本研究旨在調(diào)查青島地區(qū)大腸埃希菌臨床分離株中blaCTX-M基因和PMQR基因的流行性,為醫(yī)院感染控制和臨床治療提供理論依據(jù)。
107株大腸埃希菌于2012年采自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的門(mén)診和住院患者。采集樣品來(lái)自不同的臨床標(biāo)本,包括血液、膽汁、胸腹水、導(dǎo)管、咽拭子、膿瘡或傷口等。細(xì)菌鑒定采用Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng),細(xì)菌耐藥性檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI 2010)進(jìn)行,以EscherichiacoliATCC25922 和KlebsiellapneumoniaeATCC700603作為質(zhì)控菌株。
離心柱型-基因組提取試劑盒和電泳級(jí)瓊脂糖(北京天根生化科技有限公司)、PCR試劑盒和核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)及限制性內(nèi)切酶FokI(大連寶生物工程有限公司)、Mueller-Hinton培養(yǎng)基(英國(guó)Oxoid公司)、PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha Innotech公司)、Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(法國(guó)Biomérieux公司)。
使用離心柱型-基因組提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA,blaCTX-M基因和PMQR基因篩選引物參照文獻(xiàn)報(bào)道[3-5](見(jiàn)表1),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以細(xì)菌基因組DNA為模板,PCR檢測(cè)菌株帶有的blaCTX-M基因和各種PMQR基因(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA及oqxB基因),選取代表性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定。對(duì)于aac(6’)-Ib-cr基因,PCR技術(shù)[5]檢測(cè)菌株帶有的aac(6’)-Ib基因,陽(yáng)性菌株的基因擴(kuò)增產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶FokI處理并進(jìn)行DNA序列測(cè)定,鑒定cr變體。
表1 本研究使用的引物信息
107株大腸埃希菌均對(duì)氨芐西林耐藥,95%的菌株對(duì)頭孢噻肟、頭孢唑啉和頭孢曲松耐藥,88%和82%的菌株分別對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥。89株細(xì)菌同時(shí)對(duì)頭孢菌素類及氟喹諾酮類藥物耐藥。詳見(jiàn)表2。
表2 大腸埃希菌對(duì)臨床常用抗生素耐藥結(jié)果(n=107)
在107株臨床分離大腸埃希菌中,90株菌帶有blaCTX-M基因,64株菌帶有一種或多種PMQR基因。其中,3株帶有qnrB基因,6株帶有qnrS基因,41株帶有aac(6’)-Ib-cr基因,5株帶有qepA基因,25株帶有oqxAB基因。qnrA、qnrC、qnrD基因未檢測(cè)到。值得注意的是,60株菌同時(shí)帶有blaCTX-M和PMQR基因,其中有10株同時(shí)帶有兩種PMQR基因,包括3株帶有aac(6’)-Ib-cr和qnrS基因,3株帶有aac(6’)-Ib-cr和qepA基因,兩株帶有aac(6’)-Ib-cr和qnrB基因,兩株帶有aac(6’)-Ib-cr和oqxAB基因;3株同時(shí)帶有三種PMQR基因,包括1株帶有aac(6’)-Ib-cr、qnrB和oqxAB基因,1株帶有aac(6’)-Ib-cr、qnrS和oqxAB基因,1株帶有aac(6’)-Ib-cr、qepA和oqxAB基因。各種耐藥基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 耐藥基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果
M:100 bp DNA Ladder;0:陰性對(duì)照;1:blaCTX-M基因(551 bp);2:qnrB基因(264 bp);3:qnrS基因(428 bp);4:aac(6’)-Ib-cr基因(482 bp);5:qepA基因(218 bp);6:oqxA基因(392 bp);7:oqxB基因(512 bp)。
在本研究中,我們對(duì)青島地區(qū)臨床分離的107株大腸埃希菌進(jìn)行了頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥物的耐藥性測(cè)定。結(jié)果表明,83%的菌株同時(shí)對(duì)頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥物耐藥,說(shuō)明分離的大腸埃希菌中存在多種耐藥基因。考慮到質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因更易引起細(xì)菌耐藥性傳播以及blaCTX-M和PMQR基因的廣泛流行,我們對(duì)細(xì)菌分離株進(jìn)行了blaCTX-M基因和四類PMQR基因的檢測(cè)。
超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamase,ESBL)是引起腸桿菌科細(xì)菌對(duì)頭孢類抗生素耐藥的主要機(jī)制,而頭孢噻肟高水解酶基因blaCTX-M是我國(guó)主要流行傳播的ESBLs基因[6]。王鳳平等[7]的調(diào)查顯示,在產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌中,主要是CTX-M型。在本研究中,95%的菌株對(duì)頭孢噻肟耐藥,blaCTX-M基因在84%的菌株中被檢測(cè)到,是流行性很高的ESBL基因。
超過(guò)80%的菌株對(duì)環(huán)丙沙星或左氧氟沙星耐藥,并且60%的菌株帶有PMQR基因。其中aac(6’)-Ib-cr和oqxAB基因流行性最高。38%的菌株帶有aac(6’)-Ib-cr基因,遠(yuǎn)高于浙江溫州[8]該基因的流行率(7%)。在臨床菌株中oqxAB基因相較其他PMQR基因報(bào)道較少,本研究中23%的菌株帶有oqxAB基因,遠(yuǎn)高于上海[9]該基因的流行率(6.6%)。56%的菌株同時(shí)帶有blaCTX-M和PMQR基因,這將更有利于多重耐藥性的傳播,進(jìn)而增加細(xì)菌性感染治療的難度。
綜上,本研究得到如下結(jié)論:首次證實(shí)blaCTX-M基因和PMQR基因在青島地區(qū)臨床分離大腸埃希菌中廣泛流行,且常共存于菌株中。這將加速該地區(qū)多重耐藥菌的產(chǎn)生并增加細(xì)菌性感染治療的難度。因而,增加對(duì)臨床多重耐藥菌及耐藥基因共存的檢測(cè),通過(guò)合理使用抗生素,防止耐藥菌株的擴(kuò)散,避免多重耐藥菌的產(chǎn)生及傳播非常緊迫。
作者簡(jiǎn)介:尉鴻飛(1986-),男,在讀碩士研究生,主要研究方向:微生物學(xué)與分子生物學(xué)。
參考文獻(xiàn):
[1]Strahilevitz J,Jacoby GA,Hooper DC,et al.Plasmid-mediated quinolone resistance:a multifaceted threat [J].Clin Microbiol Rev,2009,22(4):664.
[2]Liu BT,Liao XP,Yue L,et al.Prevalence of β-lactamase and 16S rRNA methylase genes among clinical Escherichia coli isolates carrying plasmid-mediated quinolone resistance genes from animals[J].Microb Drug Resist,2013,19(3):237.
[3]Dutour C,Bonnet R,Marchandin H,et al.CTX-M-1,CTX-M-3,and CTX-M-14 β-lactamases from Enterobacteriaceae isolated in France [J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46(2):534.
[4]Kim HB,Wang M,Park CH,et al.oqxAB encoding a multidrug efflux pump in human clinical isolates of Enterobacteriaceae [J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53(8):3582.
[5]Zhao JY,Dang H.Coastal seawater bacteria harbor a large reservoir of plasmid-mediated quinolone resistance determinants in Jiaozhou Bay,China [J].Microb Ecol,2012,64(1):187.
[6]李家斌,李 惠,李 旭,等.合肥市產(chǎn)超光譜β-內(nèi)酰胺酶菌株CTX-M型耐藥基因的初步分布[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2004,14(9):965.
[7]王鳳平,陳 清,吳奎海,等.臨床分離大腸埃希菌耐藥機(jī)制和基因分型研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2011,15(2):293.
[8]張雪青,陳增強(qiáng),陳俐麗,等.大腸埃希菌臨床分離株aac(6’)-Ib-cr基因的檢測(cè)[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,18(7):1266.
[9]Yuan J,Xu X,Guo Q,et al.Prevalence of the oqxAB gene complex in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli clinical isolates [J].J Antimicrob Chemother,2012,67(7):1655.