Survivin在甲狀腺癌中的表達及臨床意義

田忠成,邵飛飛,黨雪菲,邱 實

(吉化集團公司總醫(yī)院 化療科,吉林 吉林132012)

甲狀腺癌為較常見的惡性腫瘤,約占所有惡性腫瘤 1%,在甲狀腺腫瘤中約占 5%,占癌癥死亡病例的 0.4%,多發(fā)于中青年女性,它嚴重威脅著人類健康。因此對于甲狀腺癌的預防、檢測和治療是當前腫瘤研究的一個重點。Survivin 是凋亡抑制蛋白家族的新成員,在細胞分裂和凋亡調節(jié)上均發(fā)揮作用。尤其是其抑制凋亡作用直接或間接的與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制相關。目前,Survivin 在甲狀腺癌中的表達相關性研究尚無文獻報道。

1 材料與方法

1.1標本選取吉化集團公司總醫(yī)院近三年甲狀腺癌手術切除標本35例：按組織學分型分為乳頭狀腺癌(PTC)10例,濾泡狀癌(FTC)13例,髓樣癌(MTC)12例,另選正常甲狀腺組織12例。患者術前均未行放療或化療。收集的所有組織均分成兩份,一部分放入10%中性福爾馬林,常溫下固定用于免疫組織化學染色實驗,一部分保存于-80℃冰箱中,用于組織勻漿后進行RT-PCR檢測。

1.2試劑與引物免疫組織化學染色采用SP法。抗Survivin人單克隆抗體 購自Santa Cruze公司,S-P二抗試劑盒及DAB顯色劑購自福州邁新公司。

1.3方法

1.3.1 免疫組化按試劑盒說明書操作。用已知Survivin陽性的甲狀腺癌切片作陽性對照,結果為陽性。用己知Survivin陰性的乳腺癌切片作陰性對照,結果為陰性。 用PBS液代替一抗體作空白對照,結果為陰性。

1.3.2 RT-PCR 按Trizol試劑操作說明提取RNA,逆轉錄反應按照RT反應試劑盒說明書進行。Survivin引物:擴增片段長度816 bp,上游引物：5′- TTTTCATCGTCGTCCCTA-3′ 下游引物：5′-GTTTGGCTTGCTGGTCTC-3′。GAPDH引物：擴增片段長度616 bp上游引物：5′- GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′ 下游引物：5′- AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3′。取PCR反應液10 μl進行瓊脂糖凝膠電泳,利用1D KODAK凝膠圖像分析系統攝片。

1.4 結果判定

1.4.2 RT-PCR陽性條帶判定方法 與Marker 相比較在 816bp 和 616bp 處出現陽性條帶者分別判定為Survivin 和 GAPDH mRNA 陽性表達；如在對應區(qū)域未見陽性條帶出現,則判定為陰性。用內參照(GAPDH)光密度值標化Survivin mRNA 的吸光度值,得到Survivin mRNA 表達的相對含量。具體計算公式如下： Survivin相對含量=(Survivin光密度值/GAPDH光密度值)×100。

2 結果

2.1 SP法免疫組織化學染色結果顯示,在不同組織學類型的甲狀腺癌中,Survivin的表達強度存在差異。在10例甲狀腺乳頭狀癌中,6例表達陽性,陽性率為60%。在13例甲狀腺濾泡癌中,9例表達陽性,陽性率69.2%。在12例髓樣癌中,11例表達陽性,陽性率為91.6%。而12例正常甲狀腺組織中,2例表達陽性,陽性率為16.7%。根據陽性結果判斷標準,Survivin在不同組織學分型的甲狀腺癌中表達強度存在差異。統計結果顯示,Survivin在正常甲狀腺組織中的表達與乳頭狀甲狀腺癌、濾泡癌、髓樣癌中的表達相比均具有顯著差異(P<0.05)。在甲狀腺癌中,不同組織學類型中Survivin表達具有差異,隨著其組織學惡性度的增加,Suivivin表達增強(表1)。

表1 Survivin在正常甲狀腺及甲狀腺癌中的表達及其與組織學分型的關系

注：*乳頭狀癌、濾泡癌、髓樣癌與正常甲狀腺比較P<0.05

2.2RT-PCR檢測電泳結果顯示,所有檢測的甲狀腺癌及正常甲狀腺組織均在816 bp處出現條帶,但各組之間條帶亮度存在差異(圖1)。Survivin在甲狀腺乳頭狀癌中的相對表達值為59.154±10.086,在濾泡癌中的相對表達值為67.25±8.478,在髓樣癌中的相對表達值為86.898±6.944,而在正常甲狀腺組織中的相對表達值為32.148±9.513。與正常甲狀腺組織相比。Survivin在各組織分型的甲狀腺癌中表達顯著提高(P<0.05)。Survivin在甲狀腺癌中的表達隨甲狀腺癌組織學惡性度的提高而呈上升趨勢(圖2)。

1：Marker 2：正常甲狀腺 3：乳頭狀癌 4：濾泡癌 5：髓樣癌

*與正常甲狀腺比較P<0.05

3 討論

Survivin是新近發(fā)現的抑制凋亡蛋白(IAP)家族中的新成員,在腫瘤細胞的凋亡過程中的調控作用已受到科學工作者的關注。Survivin的表達具有特異性,除在發(fā)育的胚胎組織中,Survivin僅存在于胸腺、睪丸和分泌期的子宮內膜,但在轉化的細胞系和所有人類最常見的惡性腫瘤如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、結腸癌和肺癌中大量表達。Survivin的這一表達特性提示了細胞凋亡調控和腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的之間關系,因此,Survivin有可能成為腫瘤診斷治療的一個理想靶點。

3.1Survivin的結構和抗凋亡作用Survivin 是 1997 年篩選克隆出來的新基因。人類 Survivin 基因位于染色體 17q25,全長 14.7kb,由 3 個內含子和 4 個外顯子組成。Survivin是分子量最小的凋亡抑制蛋白分子。它的基因編碼一個由 142 個氨基酸組成的分子量約為 16.2kD 的胞漿蛋白[1]。其結構獨特,僅含有單一的桿狀病毒 IAP 重復序列功能區(qū)和一個á螺旋,沒有鋅指結構。Survivin 通過其不同的氨基酸殘基與半胱氨酸蛋白酶 Caspases-3 和 Caspases-7 結合抑制 Caspases 的活性。同時通過其一個á螺旋結構與細胞分裂微觀結合,抑制細胞凋亡[2]。大量研究表明Survivin的表達具有細胞周期依賴性,只在細胞周期的G2/M期表達,并與細胞分裂、增殖有關。

研究結果表明 Survivin 是迄今發(fā)現最強的凋亡抑制因子,它的作用遠遠大于bcl-2家族的作用。它能夠直接抑制Caspases-3和Caspases-7的活性[3]。正常情況下,活化的 Caspase 酶具有嚴格的底物特異性和高效性,它可以以一種和諧的方式選擇剪切一組蛋白質,導致其功能的喪失或結構變化,而促使細胞凋亡。當 Caspases 的活性受到抑制,細胞凋亡與增殖之間的動態(tài)平衡失調時,就可能引起多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。李鵬[4]等發(fā)現Survivin 基因對人乳腺癌 MCF-7 細胞的凋亡具有一定的抑制作用,可作為人乳腺癌生物治療的候選基因。Bobayashi 等研究發(fā)現,在細胞增殖的組織中均有 Survivin 表達。Survivin 在胚胎組織中規(guī)律性表達,參與細胞的生長、分化[3]。在激活的鼠脾臟 T 細胞和處于細胞周期 S 到G2/M 期的 NIH3T3 細胞均有 Survivin 表達,可見,Survivin 表達與細胞分裂、增殖有關。

3.2Survivin在腫瘤中的表達及其與腫瘤的關系研究發(fā)現,Survivin 可廣泛表達于人類各種腫瘤組織,它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。體內外研究表明,Survivin 可在多種轉化細胞中表達,Serela等[5]發(fā)現結腸癌中Survivin表達水平同結腸癌的病理進程相關。Survivin表達陽性患者5年生存率明顯低于Survivin表達陰性患者,提示Survivin表達水平是結腸癌患者預后判斷的重要指標。Falleni等[6]發(fā)現Survivin在非小細胞肺癌腫瘤標本中的表達率明顯高于正常肺組織標本的表達率,在所有肺癌組織學類型中鱗狀細胞癌Survivin表達最高。Dong等[7]對102例喉癌進行研究發(fā)現,臨床Ⅲ期-Ⅳ期患者的Survivin的陽性表達率顯著高于Ⅰ期-Ⅱ期的Survivin的陽性表達率；病理分級Ⅲ級患者的Survivin的陽性表達率顯著高于I級患者的Survivin的陽性表達率。李世金等[8]發(fā)現Survivin蛋白的表達降低在正常子宮內膜向內膜樣腺癌的轉變中起重要作用;其低表達與子宮內膜樣腺癌的病理分期、組織學分級無明顯相關性。李慶霞等[9]發(fā)現Survivin與乳腺浸潤性導管癌侵襲和轉移有關,有助于判斷預后。Survivin 表達預示著腫瘤有較高的侵襲性和不良預后?？勺鳛轭A測腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預后的一個新指標。

3.3Survivin在甲狀腺癌表達及其臨床意義在甲狀腺癌方面,也有學者研究了Survivin的表達及其同臨床指標的相關性。劉鋼等[10]利用免疫組織化學方法檢測了68 例甲狀腺癌、54 例甲狀腺腺瘤、 32 例癌旁組織和 23 例正常甲狀腺組織中的Survivin表達情況,結果顯示Survivin 過量表達可能與甲狀腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關,癌組織中 Survivin的表達可作為判斷甲狀腺癌病理類型和預后的參考指標。盧秀波等[11]檢測了Survivin在正常甲狀腺和分化型甲狀腺癌(DTC)的表達情況,結果顯示Survivin在正常甲狀腺組織中表達陰性,在DTC中的表達陽性率為59.6%,并與有無淋巴結轉移密切相關。董文榮等[12]探討了分化型甲狀腺癌組織中Survivin的表達同腫瘤微血管形成的關系。結果表明,在47例分化型甲狀腺癌中Survivin的陽性表達率為46.8%,甲狀腺腺瘤和正常甲狀腺組織中均為陰性。Survivin的表達同甲狀腺的臨床分期、腫瘤包膜完整情況及頸部淋巴結轉移等密切相關。

本實驗中,我們檢測了Survivin蛋白在不同組織學類型甲狀腺癌中的表達情況,其結果同其它研究者的研究結果基本一致,在正常甲狀腺中呈陰性表達,在乳頭狀癌、濾泡癌和髓樣癌中的表達率分別為60%、69.2%和91.6%。表達強度隨著腫瘤惡性度的增高而增高。提示Survivin可能在甲狀腺癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用并同甲狀腺癌的惡性度、進展等密切相關。陽性表達率稍高于其他研究者的研究結果,這可能與我們的標本來源、標本數量及陽性結果判斷標準存在差異有關。同時,我們還運用RT-PCR方法檢測了Survivin mRNA在正常甲狀腺和甲狀腺癌中的表達,得到了與免疫組織化學相同的結果。在正常甲狀腺組織中,我們同樣檢測到了Survivin mRNA的極低表達,這可能同RT-PCR的高靈敏度相關。由于標本來源問題,我們沒有建立甲狀腺癌的相關臨床指標庫。但是綜合我們同其他研究者的研究結果,我們認為 Survivin在甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,與甲狀腺癌的浸潤侵襲、轉移等密切相關,可能成為甲狀腺癌患者預后判斷的重要指標,也可能是甲狀腺癌臨床診斷治療的新靶點,具有重要的臨床意義。

作者簡介：田忠成(1971-),男,碩士研究生，吉化集團公司總醫(yī)院化療科 副主任醫(yī)師。主要研究方向為腫瘤內科診斷與治療。

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[12]董文榮,李曉明,路秀英,等.Survivin 在分化型甲狀腺癌組織中的表達及其與腫瘤微血管形成的關系[J].臨床耳鼻咽喉科雜志,2006,20(21)：967.