不同負(fù)荷的游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠認(rèn)知能力及海馬神經(jīng)疲勞的影響

劉忠民，高 喆，牛 娜，董煒達(dá)

(吉林大學(xué)體育學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130012)

許多研究表明，運(yùn)動(dòng)對(duì)學(xué)習(xí)記憶的認(rèn)知能力有促進(jìn)作用[1-3]。海馬(Hippocampus)是認(rèn)知功能的靶腦區(qū)，海馬神經(jīng)的突觸可塑性可直接影響學(xué)習(xí)與記憶功能[4]。一氧化氮合酶(n-NOS)作為一種神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)元之間起信息傳遞作用，參與神經(jīng)發(fā)育、調(diào)節(jié)，在學(xué)習(xí)記憶的認(rèn)知過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。但是，低濃度的一氧化氮( nitric oxide ， NO ) 可以起到信使作用， 而過(guò)量的 NO 則導(dǎo)致神經(jīng)元的疲勞甚至損傷。研究表明，慢性綜合應(yīng)激可導(dǎo)致海馬-氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)表達(dá)增加，產(chǎn)生過(guò)量的 NO，使海馬神經(jīng)元受損[6]。目前，有關(guān)海馬神經(jīng)在承受不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷(應(yīng)激)條件下，學(xué)習(xí)記憶能力的發(fā)揮及神經(jīng)疲勞或損傷的研究尚屬少見(jiàn)。因此，以不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷作為應(yīng)激原，以學(xué)習(xí)記憶能力為認(rèn)知行為的指標(biāo)，以海馬神經(jīng)n-NOS的表達(dá)為切入點(diǎn)，研究和探討運(yùn)動(dòng)干預(yù)認(rèn)知機(jī)能的效果及疲勞機(jī)制，對(duì)促進(jìn)腦健康，預(yù)防腦老化具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

將吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的體重350±20 g的Wistar雄性大鼠40只，隨機(jī)分成對(duì)照組和每天進(jìn)行15 min、30 min、60 min小、中、大游泳運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的實(shí)驗(yàn)組[7]。各組樣本數(shù)為10，實(shí)驗(yàn)控制時(shí)間為8周。游泳時(shí)在水溫30℃±1℃，直徑150 cm、高80 cm、水深70 cm的圓形游泳池中進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)取材及免疫組化方法

最后一次運(yùn)動(dòng)后即刻取材，用0.3%的戊巴比妥鈉(35-50 mg/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，隨后用4%的多聚甲醛心臟灌流固定；迅速打開(kāi)顱腔取腦，將腦泡入4%的甲醛中再固定。 免疫組織化學(xué)染色方法嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，具體實(shí)施過(guò)程參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。

1.3 圖像解析與數(shù)據(jù)處理

圖像分析用Trintron Multiscan G500圖像分析儀。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析；組間檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

學(xué)習(xí)記憶的認(rèn)知能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1所示。達(dá)標(biāo)所需訓(xùn)練次數(shù)，與對(duì)照組比較，中等負(fù)荷組所需的訓(xùn)練次數(shù)顯著減少(P<0.05)，而大強(qiáng)度組顯著增加(P<0.05)，中等強(qiáng)度與大強(qiáng)度組間相比，差異非常顯著(P<0.01)。學(xué)習(xí)達(dá)標(biāo)過(guò)程中出現(xiàn)錯(cuò)誤次數(shù)，與對(duì)照組相比，中等強(qiáng)度組顯著減少(P<0.05)，而大強(qiáng)度組顯著增加(P<0.05)；中等強(qiáng)度與大強(qiáng)度組間差異顯著(P<0.01)。

表1 大鼠達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需的訓(xùn)練次數(shù)及錯(cuò)誤次數(shù)

注：*與對(duì)照組比P<0.05，＊中等強(qiáng)度與大強(qiáng)度組間比P<0.01

從表2中可以看出，隨著運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增加，海馬神經(jīng)n-NOS陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)顯著提高。與對(duì)照組比較，中、大運(yùn)動(dòng)負(fù)荷組均具有非常顯著的差異(P<0.01)；與小運(yùn)動(dòng)負(fù)荷組比較，中等運(yùn)動(dòng)負(fù)荷組差異顯著(P<0.05)，大強(qiáng)度負(fù)荷組呈現(xiàn)非常顯著的差異(P<0.01)；大強(qiáng)度的負(fù)荷組非常顯著的高于中等負(fù)荷組(P<0.01)。

免疫組織化學(xué)觀察n-NOS陽(yáng)性神經(jīng)元呈棕褐色，著色主要位于胞漿內(nèi)，大強(qiáng)度負(fù)荷組染色較淺。見(jiàn)圖1。

表2 不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷組海馬神經(jīng)n-NOS陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果

注：與對(duì)照組比▲P<0.01，與小負(fù)荷比★P<0.05、☆P<0.01，#中、大運(yùn)動(dòng)負(fù)荷組間比較P<0.01

圖1 n-NOS陽(yáng)性神經(jīng)元在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

3 討論

運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體的影響作用是通過(guò)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的刺激來(lái)實(shí)現(xiàn)的，過(guò)低的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷達(dá)不到運(yùn)動(dòng)的效果，過(guò)大的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)疲勞，追求理想的運(yùn)動(dòng)效果就是尋求適宜的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷。運(yùn)動(dòng)對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力影響的研究是近年許多研究者們高度關(guān)注的研究領(lǐng)域。海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要區(qū)域[9]，海馬神經(jīng)元的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用(LTP)是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)[10]。作為神經(jīng)型的一氧化氮合酶(n-NOS)主要存在于神經(jīng)細(xì)胞中，參與學(xué)習(xí)記憶功能[11]NO作為一種神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)元之間起內(nèi)信息傳遞作用，參與學(xué)習(xí)記憶等許多生理過(guò)程[12]。運(yùn)動(dòng)對(duì)海馬神經(jīng)的影響涉及在許多方面，本研究通過(guò)不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的干預(yù)，研究和探討了對(duì)海馬神經(jīng)影響的行為特征和n-NOS表達(dá)水平。其結(jié)果表明中等運(yùn)動(dòng)負(fù)荷對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的認(rèn)知能力及海馬神經(jīng)n-NOS活性表達(dá)水平的效果是最佳的。這與運(yùn)動(dòng)作為一種應(yīng)激源，可使不同腦區(qū)的n-NOS活性增高[13]；Krukoff等，隨著運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的加大，n-NOS陽(yáng)性神經(jīng)元的活性增強(qiáng)[14]以及中等負(fù)荷和大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，可以引起海馬CA1區(qū)NOS及其亞型表達(dá)升高[15]的研究結(jié)果是一致的。這些研究都證實(shí)了運(yùn)動(dòng)對(duì)海馬區(qū)n-NOS活性增強(qiáng)的效果。其機(jī)制可能與海馬神經(jīng)突觸后NMDA受體及非NMDA受體激活后，Ca2+內(nèi)流，與CaM一起活化n-NOS，催化L-Arg產(chǎn)生NO[16]有關(guān)。但是，我們的研究還發(fā)現(xiàn)，在大運(yùn)動(dòng)負(fù)荷干預(yù)下海馬神經(jīng)n-NOS雖然顯著表達(dá)，但是，學(xué)習(xí)記憶能力與中等運(yùn)動(dòng)負(fù)荷組比顯著下降。可見(jiàn)，海馬區(qū)的n-NOS活性表達(dá)效果并非是越高越好。劉鴻宇等研究顯示，大負(fù)荷訓(xùn)練后，大鼠海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)和CA3區(qū)n-NOS陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量、面積和灰度值均顯著高于對(duì)照組，其量超出海馬神經(jīng)元抗NO毒性能力時(shí)，導(dǎo)致機(jī)體進(jìn)入疲勞狀態(tài)[17]?？梢?jiàn)，NO具有在適宜運(yùn)動(dòng)負(fù)荷下對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)和在持續(xù)大負(fù)荷條件下毒性作用的兩重性。其可能機(jī)制與大負(fù)荷訓(xùn)練促使海馬神經(jīng)細(xì)胞NOS活性增強(qiáng)，NO濃度升高，在一定范圍內(nèi)可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，參與調(diào)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞的多項(xiàng)功能；而長(zhǎng)期疲勞訓(xùn)練致使海馬組織細(xì)胞內(nèi)NO濃度過(guò)高而產(chǎn)生毒性，甚至使海馬組織細(xì)胞出現(xiàn)微損傷導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力的下降[18]。這一研究提示我們，運(yùn)動(dòng)對(duì)海馬神經(jīng)的良性影響作用是在一定的生理范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)的，追求適宜的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷才能達(dá)到理想的效果，其機(jī)制有待進(jìn)一步的分析和研究。

作者簡(jiǎn)介：劉忠民(1960-),男，教授，博士，研究方向：運(yùn)動(dòng)與健康研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Fordyce D E,Farrar R P.Physical Activity Effects on Hippocampal and Parietal Cortical Cholinergic Function and Spatial Learning in F344 Rats[J].Behav Brain Res,1991,(43):115.

[2]Fordyce DE,Starnes JW,Farrar RP.Compensation of the Age-related Decline in Hippocampal Muscarinic Receptor Density Through Daily Exercise or Underfeeding[J].J Gerontol B Psychol Sci Soc Sci,1991,(46):B245.

[3]Fordyce D E,Wehner J M.Physical Activity Enhances Spatial Learning Performance with an Associated Alteration in Hippocampal Protein Kinase C Activity in C57BL/6 and DBA/2 Mice[J].Brain Res,1993,619:111.

[4]Cotman C W,Engesser Cesarc.Exercise enhances and protects brain function[J].Exe Sport Sci Rev,2002,30:75.

[5]Nikolaos Pitsikas.The nitric oxide (NO) donor molsidomine antagonizes scopolamine and L-NAME-induced performance deficits in a spatial memory task in the rat?[J].Behavioural Brain Res,2009,200(8):160.

[6]Kone BC,Kuncewicz T,Zhang W,et al.Protein interactions with nitric oxide synthases:controlling the right time,the right place,and the right amount of nitric oxide[J].Am J Physiol Renal Physiol,2003,285(2):F178.

[7]LinW J.Review and research ideas on Psycho neuron immunology [J].Acta Psychologica Sinica,1997,29(3):301.

[8]劉忠民，劉敬陽(yáng)，趙立君，等.不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷對(duì)大鼠海馬神經(jīng)NGF和n-NOS表達(dá)的影響及其意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011,37(3):437.

[9]CAO L，WANG F，YANGQ G，et al．Reduced thyroid hormones with increased hippocampal SNAP-25 and Muncl8-1 might involve cognitiveimpairment during aging[J]．Behav BrainRes，2012，229(1)：131.

[10]MORRIS A M，CHURCI-IWELL J C，KESNER R P et al．Selective lesions of the dentate gyms produce disruptions in place learning for adjacent spatial locations[J]．Neurobiology of Learning and Memory，2012，97(3)：326.

[11]LinW J.Review and research ideas on Psycho neuron immunology [J].Acta Psychologica Sinica,1997,29(3):301.

[12]SEGIETH j，PEARCE B，F(xiàn)OWLER L，el a1．Regulatory role of nitricoxide over hippocampal 5-HT release in vivo[J]．Naunyn SchmiedebergsArch Pharmacol，2001，363(3)：302.

[13]張世儀,陳紀(jì)君,左萍萍,等.學(xué)習(xí)過(guò)程腦內(nèi)一氧化氮變化的研究(簡(jiǎn)報(bào)) [J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào),1997,19(l):17.

[14]Krukoff TL,Geheten F,Ganten D.Gene expression of brain nitric oxide synthase and guanyly lcyclase in hypothalamus and medulla of two kidney one elip hypertensive rats[J].Hypertension,1995,26:171.

[15]孫國(guó)欣,田振軍,何江明,等.不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)一氧化氮合酶表達(dá)的影響[J].天津體育學(xué)院院報(bào),2006,1(28):18.

[16]薛帥如，徐 波，等.運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)海馬LTP信號(hào)級(jí)聯(lián)分子的影響[J].中國(guó)體育科技,2007,43(4):140.

[17]劉鴻宇,劉定一,楊桂姣,等.運(yùn)動(dòng)性疲勞對(duì)大鼠杏仁體一氧化氮合酶表達(dá)的影響[J].體育科學(xué),2005(2):79.

[18]趙永壽.運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠長(zhǎng)期停訓(xùn)后海馬一氧化氮合成酶的表達(dá)變化[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2011,28(4):9.