強(qiáng)直性脊柱炎患者TNF-α表達(dá)水平測定分析

張 璐，鄒紅云，余伍忠，王 錚，焦 敏

(蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院 全軍臨床檢驗(yàn)診斷中心，新疆 烏魯木齊830000)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種類風(fēng)濕因子陰性以慢性炎癥為主要病理表現(xiàn)的自身免疫性疾病，病變主要累及中軸關(guān)節(jié)，其中以骶髂關(guān)節(jié)最為常見，髖關(guān)節(jié)、椎間關(guān)節(jié)等也有受累。AS發(fā)病隱匿且呈進(jìn)行性，早期主要臨床表現(xiàn)為無原因關(guān)節(jié)酸痛，凌晨疼痛感較強(qiáng)，起床活動(dòng)后緩解，易被患者忽視，導(dǎo)致漏診，從而延誤最佳治療時(shí)期。晚期患者可發(fā)生脊柱畸形，失去勞動(dòng)能力，致殘率高，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量[1]。目前臨床上除使用一些藥物緩解急性期癥狀和日常的功能鍛煉外，尚缺乏針對(duì)AS的特異性治療。至今AS的具體發(fā)病機(jī)制仍不明確，多認(rèn)為是遺傳易感性、微生物感染、內(nèi)分泌失調(diào)等多種因素綜合作用下導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能障礙所致[2]。近年來一些炎性細(xì)胞因子在風(fēng)濕免疫性疾病發(fā)病機(jī)制及其與疾病活動(dòng)相關(guān)性的研究中的作用日益受到重視。其中腫瘤壞死因子α(TNF-α)就是一類重要的細(xì)胞因子。適量的TNF-α可以調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫、殺傷靶細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。而其過量表達(dá)則會(huì)損傷機(jī)體。通過對(duì)AS患者外周血TNF-α表達(dá)量的測定，本文旨在探索其在AS發(fā)病機(jī)制中的作用及為AS的生物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

1.1.1 收集蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院自2012年2月-10月中醫(yī)科、骨科確診的門診及住院AS患者60例作為研究對(duì)象，均符合1984年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American College of Rheumatology,ACR)修訂的紐約診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]?；颊邽槌踉\、未經(jīng)治療，或者停藥后復(fù)發(fā)尚未經(jīng)再次治療的病例，排除其他自身免疫性疾病和感染性疾病表現(xiàn)。其中男性患者47例，女性13例，HLA-B27(+)患者56例，HLA-B27(-)患者4例，年齡為13-56歲，平均年齡30.44±10.15歲。同時(shí)納入健康人40例作為正常對(duì)照，并進(jìn)行性別與年齡匹配，年齡為18-52歲，平均年齡32.71±9.23歲。

1.1.2 標(biāo)本采集 在以上入選人群中選取性別年齡匹配的20例AS患者與15例健康人，靜脈采血5 ml(EDTA抗凝)，2 ml用于分離血清，-70 ℃保存?zhèn)溆?；其? ml用于分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。其余入選者靜脈采血2 ml,乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)抗凝，收集上清，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑及儀器

1.2.1 試劑 人TNF-α ELISA檢測試劑盒(美國R&D公司)；淋巴細(xì)胞分離液；RPMI1640培養(yǎng)液；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)；TRlzol Reagent(invitrogen公司)；SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司)；DEPC水；DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)。

1.2.2 儀器 上海安泰AT-858自動(dòng)酶標(biāo)分析儀；ThermoFisher888型洗板機(jī)；HC-3018高速低溫冷凍離心機(jī)；羅氏LightCycler 480Ⅱ RealTime PCR儀；DYY-Ⅲ6型穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀；SC 645上海山富凝膠攝像系統(tǒng)；杭州博日GENETROTC-E PCR儀。

1.3引物序列

參照相關(guān)文獻(xiàn)[4]，合成人TNF-α和β-actin內(nèi)參照兩對(duì)引物，以上引物由Invitrogen上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。

表1 人TNF-α和β-actin引物序列

1.4方法

1.4.1 ELISA法測定血漿中TNF-α蛋白含量 TNF-α含量測定：試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定。具體操作過程嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行，每一樣本做3個(gè)復(fù)孔。終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀分別在450 nm和570 nm處測OD值，在450 nm處測得OD值中扣除570 nm處的OD值，以消除本底的影響。以0孔為空白，所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的吸光度減去空白吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得血漿中TNF-α含量(ng/L)。

1.4.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)提取 應(yīng)用密度梯度離心法分離PBMC，將分離出的PBMC溶于Trizol試劑中，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 樣本總RNA提取及鑒定 采用Trizol一步法提取樣本總RNA，取5 μl RNA產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠電泳下鑒定。

1.4.4 cDNA合成 按PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit操作說明配制反應(yīng)體系，按照cDNA Kit合成條件逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4.5 熒光定量RT-PCR反應(yīng) 以上述反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，人β-actin基因?yàn)閮?nèi)參照，應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測TNF-α基因mRNA表達(dá)量。操作過程嚴(yán)格按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書進(jìn)行，每一個(gè)樣本的目的基因和內(nèi)參基因各做3個(gè)復(fù)孔，取平均值作為該樣本的最終CT值。反應(yīng)體系為20 μl：SYBR Premix Ex Taq (2 x) 10.0 μl，cDNA模板2.0 μl，上、下游引物各(10 μM)0.4 μl，dH2O(滅菌蒸餾水) 7.2 μl。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s 1cycles；95℃ 5 s，62℃ 20 s 40cycle。融解曲線分析： 95℃ 0 s；65℃ 15 s；95℃ 0 s。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1ELISA法測定血漿中TNF-α蛋白含量檢測結(jié)果表明，AS患者血漿中TNF-α含量(26.307±15.737 )ng/L高于健康人TNF-α血漿含量(11.147±13.868)ng/L，P=0.027(<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 AS組與健康對(duì)照組血漿TNF-α水平

2.2熒光定量RT-PCR結(jié)果

在2%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)可見條帶清晰(見圖1)，長度準(zhǔn)確的目標(biāo)條帶，且周圍無雜帶即產(chǎn)物中沒有出現(xiàn)過多的非特異性擴(kuò)增，說明該P(yáng)CR體系良好，定量準(zhǔn)確，退火溫度摸索正確。

圖1 AS病例組與健康對(duì)照組部分樣本熒光定量PCR產(chǎn)物電泳圖

注：M：DL2000 DNA Marker ;1和2：TNF-α;3和4：:β-actin 5：空白對(duì)照

熒光定量PCR系統(tǒng)在產(chǎn)物延伸過程中開始監(jiān)測熒光強(qiáng)度，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，擴(kuò)增結(jié)果采用CT值的形式表示。CT值代表在PCR擴(kuò)增過程中每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，可通過CT值對(duì)起始模板量進(jìn)行定量分析。TNF-α mRNA表達(dá)量用2-△CT表示，其中△CT=待測樣本(CT目的基因-CTβ-actin)。AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)量為0.0024±0.0177,健康體檢者TNF-α mRNA表達(dá)量為0.0014±0.0004，且P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與ELISA檢測結(jié)果相符(見表3)。

表3 外周血單個(gè)核細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)量

3 討論

AS被認(rèn)為是一種復(fù)雜的多基因遺傳疾病，其發(fā)病機(jī)制目前仍不明確。迄今為止，研究較為明確的是人類白細(xì)胞抗原B27(human leucocyte antigen B27,HLA-B27)與AS發(fā)病密切相關(guān)。有調(diào)查顯示，HLA-B27陽性的人患AS的概率是陰性者的200-300倍[5]。現(xiàn)在HLA-B27檢測已經(jīng)成為診斷AS的重要輔助手段，但遺傳背景只能決定個(gè)體對(duì)疾病的遺傳傾向和易感性，但卻不是疾病發(fā)生的最終因素。

近年來細(xì)胞因子(cytokine,CK)在AS發(fā)病機(jī)制中逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。CK是一類由免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞合成和分泌的低分子質(zhì)量可溶性蛋白質(zhì)，適量的細(xì)胞因子具有生物活性作用能夠發(fā)揮一定的免疫調(diào)節(jié)功能，而其過量分泌則將導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和自身免疫功能紊亂。研究證實(shí)，不同自身免疫病患者體內(nèi)存在不同類型細(xì)胞因子表達(dá)異常。各種細(xì)胞因子在疾病中互相聯(lián)系，共同作用，形成十分復(fù)雜的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)。其中TNF-α就是這樣一種重要的細(xì)胞因子，隨著研究的深入，它在自身免疫病中的重要作用正日益突顯。

TNF-α是由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的一種小分子多肽，通過結(jié)合其相應(yīng)受體發(fā)揮生物學(xué)作用。最早發(fā)現(xiàn)TNF-α可以使腫瘤細(xì)胞變性壞死[6]，在體內(nèi)起到一定的免疫監(jiān)視作用，故此得名。適量的TNF-α可以調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫、殺傷靶細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。而其過量表達(dá)則會(huì)損傷機(jī)體。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α也是一種重要的炎癥因子，當(dāng)機(jī)體受到感染、損傷等刺激后，體內(nèi)TNF-α能激活中性粒細(xì)胞，改變血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，調(diào)節(jié)其它組織代謝活性。TNF-α也可以作用于纖維母細(xì)胞和骨細(xì)胞，與關(guān)節(jié)僵硬有關(guān)。而AS正是以慢性炎癥和異常骨化為病理特點(diǎn)的一類自身免疫性疾病。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TNF-α轉(zhuǎn)基因鼠可產(chǎn)生自發(fā)性關(guān)節(jié)炎，而抗TNF-α單克隆抗體可以抑制其發(fā)病。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ELISA法檢測AS患者和健康人血漿中TNF-α蛋白含量，結(jié)果顯示AS患者血漿中TNF-α平均含量為(26.307±15.737)ng/L高于健康人血漿TNF-α含量(11.147±13.868)ng/L，且P=0.027(<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步采用SYBR Green非特異性熒光染料方法對(duì)AS患者和健康體檢者PBMC TNF-α mRNA含量進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光檢測，該方法避免了普通PCR只能對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析而無法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量這一弊端，此方法對(duì)DNA模板沒有選擇性，不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物探針，且反應(yīng)快速靈敏，定量準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)量為0.0024±0.0177,健康體檢者TNF-α mRNA表達(dá)量為0.0014±0.0004，AS患者的表達(dá)量顯著高于健康人，且P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。還有研究發(fā)現(xiàn)AS發(fā)病機(jī)制中所涉及的遺傳因素除HLA-B27以外，尚有HLA區(qū)域內(nèi)外的其他基因參與[7,8]。由于TNF-α基因定位于人類6號(hào)染色體上，同時(shí)具有十分廣泛的免疫活性，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果我們有理由推測TNF-α在AS發(fā)生發(fā)展中扮演重要作用。

某一基因表達(dá)量增加，其影響因素有很多。比如該基因拷貝數(shù)增加或者基因的調(diào)控序列發(fā)生突變，再或者是該基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平降低，從而使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，易于與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。這些因素都有可能導(dǎo)致TNF-α基因表達(dá)量增高，進(jìn)而產(chǎn)生一系列異常生物學(xué)效應(yīng)。

本研究擬通過檢測AS患者外周血TNF-α的表達(dá)量，為進(jìn)一步在基因水平揭示其在AS發(fā)病機(jī)制中的作用提供新的線索和思路，也為以細(xì)胞因子為靶點(diǎn)的臨床治療提供有力實(shí)驗(yàn)依據(jù)

作者簡介：張璐(1985-) ，女，遼寧阜新人，碩士研究生。

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