2型糖尿病性勃起功能障礙大鼠模型的建立及氧化應(yīng)激對(duì)海綿體組織內(nèi)nNOS表達(dá)的影響

孔東波，查文良，郭宗華，江波濤

(咸寧市中心醫(yī)院泌尿外科，湖北 咸寧 437100)

勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)是指多種原因造成的陰莖海綿體血液充盈不足，致陰莖持續(xù)不能達(dá)到和/或維持足夠的勃起，以完成并維持滿意的性交，病程超過3個(gè)月就可診斷為ED。近年來(lái)我國(guó)居民生活水平得到顯著的提高，飲食結(jié)構(gòu)和生活方式也發(fā)生明顯的改變，因此2型糖尿病患者數(shù)量也急劇增加。作為糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥之一的ED，引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛的關(guān)注。大約35%～75%糖尿病男性患者患有ED[1]。以往文獻(xiàn)報(bào)道，2型糖尿病各種并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展與氧化應(yīng)激有著密切的關(guān)系，神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)在陰莖勃起的過程中起到重要作用。本研究通過建立2型糖尿病大鼠模型，探討氧化應(yīng)激與nNOS在2型糖尿病性ED發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品、試劑與儀器 兔抗鼠nNOS抗體、山羊抗兔二抗試劑盒購(gòu)自Sigma公司；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma)；阿撲嗎啡(apomorphin，APO，Sigma)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)自北京天恩澤有限公司；胰島素放免試劑盒購(gòu)自上海瑞齊生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10周齡SPF級(jí)白色雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，體質(zhì)量220g左右，購(gòu)自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，交配實(shí)驗(yàn)證實(shí)勃起功能正常。

1.3 建立2型糖尿病大鼠模型與APO實(shí)驗(yàn)檢測(cè)勃起功能 實(shí)驗(yàn)開始前40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選取30只做為實(shí)驗(yàn)組，剩下的10只作為對(duì)照組(大鼠未被行特殊處理)。實(shí)驗(yàn)組給予高脂高糖飲食且不限水，半天光照、半天黑暗條件下喂養(yǎng)4周。3d內(nèi)2次尾靜脈注射STZ，1周稱重后，按照5.0g/kg給每只大鼠用50%葡萄糖水灌胃，測(cè)定胰島素抵抗指數(shù)。2型糖尿病大鼠造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為：空腹血糖>16.7mmol/L且具有胰島素抵抗。糖尿病大鼠造模成功后繼續(xù)被給予高脂高糖飲食8周且每周測(cè)1次空腹血糖觀察一般狀況。

阿樸嗎啡(APO)試驗(yàn)：兩組大鼠飼養(yǎng)8周后稱重，將每只大鼠放到透明玻璃箱中，室內(nèi)保持安靜，燈光調(diào)暗至僅夠觀察，適應(yīng)環(huán)境15min，然后在大鼠頸部皮膚下注射阿樸嗎啡100μg/kg，觀察30min，并記錄每組大鼠陰莖勃起次數(shù)。陰莖膨大、包皮后退，龜頭充血及末端陰莖露出即為1次陰莖勃起。勃起次數(shù)≥1次，認(rèn)為是勃起實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。

1.4 標(biāo)本的處理、分光光度法測(cè)定MDA、SOD及Western Blotting技術(shù)檢測(cè)陰莖組織中nNOS的表達(dá) 阿樸嗎啡試驗(yàn)結(jié)束后，繼續(xù)禁食不禁水12h，將大鼠處死，立即分離出陰莖組織，用生理鹽水沖洗后，迅速置于-80℃超低溫冰箱中，檢測(cè)陰莖海綿體組織中超氧化丙二醛(MDA)、物歧化酶(SOD)的含量和用Western Blotting技術(shù)檢測(cè)陰莖組織中nNOS的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 2型糖尿病性勃起功能障礙大鼠模型建立與APO實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組大鼠尾靜脈注射STZ并高脂高糖飲食后開始出現(xiàn)多飲、多食、多尿，形體消瘦。對(duì)照組大鼠食欲正常，活動(dòng)有力。到全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組大鼠未有死亡，實(shí)驗(yàn)組大鼠有25只2型糖尿病造模成功，有6只在實(shí)驗(yàn)期間死于各種糖尿病并發(fā)癥。尾靜脈注射STZ，1周后所測(cè)空腹血糖、空腹胰島素及計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)見表1。

表1 兩組大鼠空腹血糖、空腹胰島素及計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)

阿樸嗎啡實(shí)驗(yàn)：10只對(duì)照組大鼠陰莖都可以勃起，勃起率為100%。最后存活19只2型糖尿病大鼠中，只有7只可以勃起，勃起率為37%。將可以勃起的7只糖尿病大鼠從實(shí)驗(yàn)組剔除。

2.2 分光光度法測(cè)定MDA與SOD 結(jié)果見表2。

表2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠陰莖組織中的MDA、SOD含量

2.3 nNOS在兩組大鼠陰莖海綿體組織內(nèi)的表達(dá)情況 由圖1可知實(shí)驗(yàn)組大鼠陰莖海綿體組織中nNOS的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組大鼠陰莖海綿體組織中的nNOS。

圖1 Western Bloting法檢測(cè)大鼠陰莖海綿體組織內(nèi)nNOS表達(dá)量

3 討 論

目前糖尿病的發(fā)病率正在快速地升高，應(yīng)用在治療糖尿病的花費(fèi)也非常的高昂[2]。在美國(guó)有多于800萬(wàn)糖尿病性ED患者[3]。專家們推測(cè)隨著糖尿病發(fā)病率的增加，糖尿病性勃起功能障礙的發(fā)病率也會(huì)大大的增加。在美國(guó)每年用在治療勃起功能障礙的直接花費(fèi)大約4億美元，其中大約1億美元是用于治療糖尿病性勃起功能障礙[3]。藥物治療糖尿病性勃起功能障礙的有效率非常低，并且藥物不能阻止和/或逆轉(zhuǎn)糖尿病性勃起功能障礙病程的進(jìn)展。研究對(duì)象是1型糖尿病，對(duì)于2型糖尿病性勃起功能障礙機(jī)制的研究還比較少[4]。更為重要的是目前缺乏對(duì)于2型糖尿病勃起功能障礙男性患者長(zhǎng)期的觀察研究，用于研究2型糖尿病勃起功能障礙機(jī)制的動(dòng)物模型也是最近幾年來(lái)才得到學(xué)者們的重視。因?yàn)樵谀行蕴悄虿』颊咧蟹且葝u素依賴性2型糖尿病患者占90%～95%。但是絕大多數(shù)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究集中在以1型糖尿病動(dòng)物模型為研究對(duì)象的勃起功能障礙發(fā)生機(jī)制的研究[5]。迄今為止，大約只有十多個(gè)研究是以2型糖尿病動(dòng)物模型為研究對(duì)象。2型糖尿病動(dòng)物模型的建立大多數(shù)選取鼠類，包括肥胖的ZDF大鼠、BBZ/WOR大鼠、OLET大鼠[6]。小鼠模型通常也可以被用來(lái)研究，包括高脂飲食的肥胖糖尿病Tsumara Suzuki小鼠、新西蘭肥胖ob/ob與db/db小鼠[7]，其中后兩種小鼠對(duì)減肥藥如來(lái)普汀缺乏敏感性。這些動(dòng)物模型與人類2型糖尿病癥狀相似通常同時(shí)具有高血糖、胰島素抵抗、高脂血癥、肥胖的特點(diǎn)。但是，這些動(dòng)物模型中只有少數(shù)幾種出現(xiàn)勃起功能障礙并可應(yīng)用于勃起功能障礙的研究。特別是對(duì)陰莖組織內(nèi)脂肪過多介導(dǎo)的勃起功能障礙機(jī)制的基礎(chǔ)研究表明，α-腫瘤壞死因子在勃起功能障礙的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[8]。但是這些實(shí)驗(yàn)研究采用的動(dòng)物模型是昂貴的遺傳性2型糖尿病大鼠模型，這些動(dòng)物模型有兩大缺點(diǎn)：①價(jià)格昂貴不利于大樣本的實(shí)驗(yàn)研究；②不能正常反應(yīng)自然病程的所有方面特征[9]。我們采用的高脂高糖飲食聯(lián)合低劑量注射STZ方法造成的糖尿病性勃起功能障礙大鼠形體消瘦，這點(diǎn)與2型糖尿病性ED患者形體消瘦相似。在全世界范圍內(nèi)非肥胖性2型糖尿病患者占所有2型糖尿病患者的42%，在我們中國(guó)絕大多數(shù)都是非肥胖性2型糖尿病患者[10]。

在陰莖勃起過程中NO是起決定作用的神經(jīng)遞質(zhì)，而NO合酶是催化 L-精氨酸分解產(chǎn)生NO的關(guān)鍵酶。NO合酶是一種含有亞鐵血紅蛋白的合酶，是由兩個(gè)亞單位組成的具有催化活性的同源二聚體，分子量約為150000KD。NO合酶是NO合成的限速酶，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有3種亞型的NO合酶：神經(jīng)型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)。在陰莖海綿體內(nèi)與NO的生成關(guān)系最為密切的是nNOS和eNOS。海綿體組織中由nNOS催化合成的NO在陰莖勃起中起著“扳機(jī)”作用[11]。當(dāng)機(jī)體受到性刺激時(shí)，陰莖組織中nNOS被激活短暫釋放少量的NO引起陰莖脈管系統(tǒng)和海綿竇中平滑肌舒張導(dǎo)致陰莖動(dòng)脈血流增加、體積膨大而啟動(dòng)陰莖勃起。血流對(duì)陰莖脈管系統(tǒng)和海綿竇血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的應(yīng)切力激活PI3-K/Akt/eNOS信號(hào)通路，使eNOS(Ser-1177)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，引起NO持續(xù)的釋放，從而使陰莖組織內(nèi)的平滑肌持續(xù)的舒張，陰莖達(dá)到完全的勃起[12]。

氧化應(yīng)激損傷是指機(jī)體內(nèi)高活性分子如活性氧簇(ROS)產(chǎn)生過多和/或消除減少而導(dǎo)致的組織損傷。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基可以與DNA、蛋白質(zhì)和多不飽和脂肪酸作用，造成DNA鏈斷裂和氧化性損傷、蛋白-蛋白交聯(lián)、蛋白-DNA交聯(lián)及脂質(zhì)過氧化。此外，自由基也極易與其它物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成新的自由基或氧化物。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，2型糖尿病性勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體組織內(nèi)的MDA含量顯著增高，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與對(duì)照組相比，2型糖尿病性勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體組織內(nèi)SOD的活性顯著的降低(P<0.05)。這的確說明了糖尿病時(shí)陰莖海綿體內(nèi)ROS顯著增加，機(jī)體抗氧化防御能力下降，使兩者原先的平衡被打破，進(jìn)一步引起勃起功能障礙。

低劑量STZ聯(lián)合高脂高糖飲食可造成2型糖尿病動(dòng)物模型。2型糖尿病可致成年雄性SD大鼠陰莖海綿體組織中MDA含量升高，SOD活性降低，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。2型糖尿病使得陰莖海綿體組織發(fā)生氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致nNOS的表達(dá)降低可能是引起糖尿病性勃起功能障礙發(fā)病的重要病因之一。

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