參附注射液對(duì)大鼠腸缺血再灌注損傷和修復(fù)的影響

王代宏，王 偉

(咸寧市中心醫(yī)院普外科，湖北 咸寧 437100)

腸黏膜缺血-再灌注損傷是創(chuàng)傷、休克后導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征的重要病因?qū)W基礎(chǔ)及中心環(huán)節(jié)。細(xì)胞異常凋亡是缺血-再灌注期間腸黏膜損傷的主要機(jī)制[1]，因此探討腸缺血-再灌注損傷和修復(fù)的防治措施非常重要。有研究表明，參附注射液能保持血液動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定、調(diào)整免疫功能、改善組織與器官的微循環(huán)[2]。我們通過(guò)觀察大鼠腸缺血-再灌注損傷時(shí)小腸組織病理學(xué)改變、細(xì)胞凋亡指數(shù)與有絲分裂活性，以探討參附注射液對(duì)腸缺血-再灌注損傷與修復(fù)時(shí)小腸上皮的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 54只雄性健康大鼠，體重200～260g，購(gòu)自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(鄂)y20090850。術(shù)前晚禁食。大鼠被隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(n=6)、腸缺血再灌注組(n=24)和參附處理組(n=24)，后兩組再分為缺血1h組、再灌注1h組、再灌注24h組和再灌注72h組，每組各6只。

1.2 方法 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)，上腹部正中切口進(jìn)腹，分離出腸系膜上動(dòng)脈，腸缺血再灌注組和參附處理組用無(wú)損傷血管夾阻斷腸系膜上動(dòng)脈血流1h，再灌注1、24、72h，參附處理組于阻斷前30min經(jīng)靜脈輸注參附注射液(雅安三九藥液公司，批號(hào)111232，速度8ml/(kg·h)，總量20ml/(kg·d)，對(duì)照組不阻斷腸系膜上動(dòng)脈血流，對(duì)照組與腸缺血再灌注組于阻斷前30min經(jīng)靜脈輸注等量生理鹽水，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均面罩給氧。在各個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上取動(dòng)物的回腸制成標(biāo)本待測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察3組在各個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的組織病理學(xué)改變，測(cè)定細(xì)胞凋亡指數(shù)和有絲分裂活性。

1.3.1 腸黏膜病理學(xué)改變 每只大鼠取2cm回腸作標(biāo)本，固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，每個(gè)標(biāo)本腸黏膜組織病理?yè)p傷采用Haglund等積分法[3]。小腸絨毛高度采用光學(xué)顯微鏡下MPIAS-500多媒彩色病理學(xué)分析系統(tǒng)測(cè)定。

1.3.2 腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)測(cè)定 采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記實(shí)驗(yàn)(TUNEL)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察小腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡情況(試劑盒購(gòu)自德國(guó))，由于凋亡細(xì)胞染色定位于細(xì)胞核呈棕黃色，在顯微鏡下細(xì)胞核具有棕黃色顆粒作為凋亡細(xì)胞。凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)是每張切片隨機(jī)取10個(gè)高位視野(×400)，每100個(gè)細(xì)胞中凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3.3 腸黏膜上皮細(xì)胞有絲分裂活性的測(cè)定 在HE染色的腸黏膜上皮細(xì)胞間觀察有絲分裂相，10個(gè)相鄰腸黏膜上皮細(xì)胞間具有有絲分裂相的細(xì)胞數(shù)作為有絲分裂活性指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 腸黏膜病理學(xué)變化 對(duì)照組為正常腸黏膜絨毛，缺血1h組部分腸黏膜絨毛分離和高度降低，對(duì)應(yīng)參附處理組顯示絨毛與腺體輕度受損，上皮下間隙擴(kuò)大，毛細(xì)血管充血；腸灌注1h組絨毛脫落、暴露與分離，腸絨毛高度降低，對(duì)應(yīng)參附處理組顯示上皮和固有層中度分離與少許絨毛脫落，病理學(xué)變化明顯好于缺血-再灌注損傷組；再灌注24h后，腸黏膜顯示不規(guī)則再生的短絨毛，上皮細(xì)胞呈立方形，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，絨毛高度明顯降低，而對(duì)應(yīng)參附處理組腸黏膜病理學(xué)改變改善明顯；灌注72h兩組腸絨毛高度增加，接近正常腸黏膜絨毛(表1)。

表1 腸黏膜缺血-再灌注損傷后腸黏膜病理學(xué)改變

2.2 腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù) 對(duì)照組顯示腸黏膜絨毛少量凋亡細(xì)胞，缺血1h組和再灌注1h組腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡增加明顯，參附處理組腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡降低，仍高于對(duì)照組。腸灌注24、72h，腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡降低明顯，與參附處理組比較，這些改變差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表2)。

表2 腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)與有絲分裂活性的改變

2.3 腸黏膜上皮細(xì)胞有絲分裂活性 與對(duì)照組及參附處理組比較，缺血1h組和再灌注1h組腸黏膜上皮細(xì)胞有絲分裂活性降低明顯，腸灌注24h，腸黏膜上皮細(xì)胞有絲分裂活性增加，腸灌注72h后接近正常水平，兩組差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表2)。

3 討 論

3.1 小腸黏膜缺血-再灌注損傷 小腸黏膜缺血15min即有絨毛頂端上皮細(xì)胞損傷，持續(xù)5h幾乎整個(gè)小腸壁壞死[1]。我們研究發(fā)現(xiàn)，缺血1h后腸黏膜絨毛分離，腸灌注1h絨毛明顯脫落、暴露與分離，黏膜屏障損害，絨毛高度與有絲分裂活性降低明顯。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡是組織缺血-再灌注損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡的重要方式，在這過(guò)程中許多病理改變?nèi)绲蛲龌?、氧自由基、炎性?xì)胞、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間鈣離子的異常分布與腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[4]。本研究也發(fā)現(xiàn)，正常小腸絨毛頂端少量細(xì)胞凋亡與小腸上皮細(xì)胞生理更新密切，腸缺血1h、再灌注1h后小腸絨毛大量上皮細(xì)胞凋亡，與腸黏膜屏障的損害程度密切相關(guān)。

3.2 小腸黏膜缺血后的修復(fù) 腸上皮細(xì)胞凋亡與增殖存在動(dòng)態(tài)平衡，是保證腸黏膜穩(wěn)定的重要機(jī)制[5]。我們實(shí)驗(yàn)證實(shí)腸再灌注24h腸黏膜上皮隱窩有絲分裂活性明顯高于再灌注1h，但腸絨毛的結(jié)構(gòu)并沒(méi)有完全恢復(fù)。腸再灌注72h腸黏膜上皮隱窩有絲分裂活性達(dá)到正常水平，結(jié)構(gòu)也接近正常腸絨毛。腸黏膜上皮細(xì)胞的修復(fù)與基因調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子、多肽生長(zhǎng)因子以及間質(zhì)組織與上皮細(xì)胞的交互作用密切相關(guān)[6]。我們觀察到腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡和DNA碎裂在小腸黏膜缺血-再灌注1h達(dá)到高峰，再灌注24h和72h降低，凋亡細(xì)胞開(kāi)始于絨毛的頂端和隱窩。這證明腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡與大量增殖、生長(zhǎng)失常和細(xì)胞老化有關(guān)，從而保持腸黏膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

3.3 參附注射液對(duì)腸黏膜缺血再灌注損傷和修復(fù)的防治作用和可能機(jī)制 參附注射液在防治腸黏膜缺血再灌注損傷方面表現(xiàn)出“多靶作用”的優(yōu)勢(shì)[7]。臨床上廣泛應(yīng)用于損傷、休克與多器官功能障礙綜合征。我們研究發(fā)現(xiàn)，在參附處理組缺血1h、灌注1h腸黏膜病理學(xué)改變好于缺血-再灌注損傷組，灌注24、72h，參附注射液的保護(hù)作用逐漸減弱，這證實(shí)參附注射液能夠減輕腸黏膜缺血再灌注損傷早期腸黏膜上皮細(xì)胞的病理學(xué)損害。參附處理組腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)低于缺血-再灌注損傷組，說(shuō)明參附注射液能夠降低腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡。與缺血-再灌注損傷組比較，在參附處理組缺血1h和灌注1h腸黏膜上皮細(xì)胞有絲分裂活性增強(qiáng)，在接下來(lái)的腸灌注24h后，兩組腸黏膜上皮細(xì)胞有絲分裂活性均明顯增加，到灌注72h達(dá)正常水平，這證實(shí)參附注射液能夠增強(qiáng)腸黏膜上皮細(xì)胞有絲分裂活性，促進(jìn)細(xì)胞的再生及修復(fù)。

腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡在腸黏膜缺血再灌注損傷與修復(fù)中起重要作用，有效維持了腸黏膜的穩(wěn)定。參附注射液能夠減輕腸黏膜缺血再灌注損傷與修復(fù)過(guò)程中腸黏膜上皮細(xì)胞的病理學(xué)損害，這種保護(hù)作用在早期尤為明顯，其機(jī)制可能是參附注射液能夠降低腸黏膜絨毛上皮細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)上皮細(xì)胞有絲分裂活性、促進(jìn)腸黏膜絨毛上皮細(xì)胞的再生及修復(fù)。

[1]Coopersmith CM， O'Donnell D， Gordon JI，et al.Bcl-2 inhibits ischemia-reperfusion induced apoptosis in the intestinal epithelium of transgenic mice[J].Am J Physiol，1999，276:G677

[2]孟慶濤，夏中元，劉先義，等.參附注射液對(duì)再灌注期間腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡的抑制[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9(47):172

[3]Haglund U，Osterberg J.Local consequences of reperfusion in the gut.Pierce A and Robert T Mathie :Ischemia-Reperfusion Injury[J].Blackwell Science，Oxford UK，1999，23:65

[4]程芳洲，唐國(guó)華，李庚山，等.大鼠心肌缺血再灌注時(shí)心肌細(xì)胞凋亡情況及缺血預(yù)處理對(duì)其影響[J].咸寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，15(4):229

[5]耿艷霞，黎介壽，李秋榮，等.大鼠小腸缺血-再灌注損傷后隱窩細(xì)胞增殖在腸黏膜屏障損傷修復(fù)中的作用[J].腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，2012，19(5):288

[6]李云勝，劉克玄，劉家欣，等.大鼠腸缺血再灌注損傷后腸黏膜差異表達(dá)蛋白質(zhì)組的分離與鑒定[J].中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2009，15(3):170

[7]Wang Dai-Hong，He Xiao-Fei，Li Xiang-Chu，et al.Protective effect of shen-fu injection on intestinal mucosal ischemia-reperfusion injury and intestinal epithelial cells at recovery phase in rats[J].Chinese Journal of Clinical Rehabilitation，2006，10(47):202