野山杏總黃酮對(duì)高血脂大鼠降血脂及抗氧化作用的研究

阿依姑麗·艾合麥提，戴小華，張 華，帕爾哈提·柔孜(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化的主要發(fā)病因素之一，與心腦血管疾病的發(fā)生直接相關(guān)，對(duì)脂質(zhì)代謝異常的達(dá)標(biāo)治療能夠有效減少外周動(dòng)脈病、心肌梗死和缺血性腦卒中的發(fā)生，減少由于高脂血癥引起的心血管病的發(fā)生[1]，同時(shí)，高脂血癥引起的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷和血液流量減少造成微循環(huán)障礙也不容忽視。因此，在防治高脂血癥的過(guò)程中，不僅要加強(qiáng)血脂的調(diào)節(jié)，而且應(yīng)重視提升機(jī)體的抗氧化能力?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，人類機(jī)體內(nèi)自由基的自穩(wěn)態(tài)平衡性下降，從而導(dǎo)致自身免疫功能下降，發(fā)生腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、原發(fā)高血壓、Alzheimer型早老性癡呆等自由基疾病[2-3]。

本文對(duì)新疆本土資源野山杏總黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定并研究其對(duì)高血脂大鼠的抗氧化作用，為野山杏資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 SK-1混勻器(常州國(guó)華電器有限公司)；UNICO 7200分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；HH-4恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)；80-2型低速離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)。

1.2 試藥 野山杏成熟果實(shí)(采自新疆哈密伊吾縣)。野山杏總黃酮(total flavonoids from wild apricot，TFWA)：取一定量的野山杏果實(shí)干粉，加50倍量的體積分?jǐn)?shù)50%乙醇超聲1 h，提取2次，抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去并回收乙醇，干燥即得野山杏總黃酮。野山杏總黃酮在給藥前用生理鹽水配成所需質(zhì)量濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

膽固醇(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號(hào) 090520)；膽酸鈉(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào) 090605)；丙基硫氧嘧啶(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào) 090525)；吐溫-80(天津市盛淼精細(xì)化工有限公司，AR)；1，2-丙二醇(天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心，AR)；血脂康膠囊(北京北大維信生物科技有限公司，批號(hào)20100108)。膽固醇(TC)試劑盒，三酰甘油(TG)試劑盒，高、低密度脂蛋白膽固醇(HDL-C、LDL-C)試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒(批號(hào) 20101126)，丙二醛(MDA)測(cè)試盒(批號(hào) 20101115)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)試盒(批號(hào) 20101101)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 動(dòng)物 雄性健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量100～120 g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(新)2003-0001。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水，無(wú)不良反應(yīng)，進(jìn)食、飲水和活動(dòng)正常者納入實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 野山杏總黃酮的含量測(cè)定

2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[4]精密稱取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品25.00 mg，置于100 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液(含蘆丁0.25mg·mL-1)，精密吸取對(duì)照品溶液0.0(空白對(duì)照)，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，各加50g·L-1亞硝酸鈉溶液0.7 mL，混勻，靜置6 min，再加100 g·L-1硝酸鋁溶液0.7 mL，混勻，靜置6 min，再加40 g·L-1氫氧化鈉5 mL，最后用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置10 min。取對(duì)照品溶液1 mL，按制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，在UV2550紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在510 nm處有最大吸收峰。因此，確定510 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，測(cè)定各溶液的吸光度，以吸光值為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：A=13.064 41C+0.037 32，r=0.999 71

2.1.2 樣品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取3 g粉碎過(guò)的野山杏果肉，加50倍量的體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇超聲1 h，提取2次，抽濾，合并濾液，得樣品溶液。

2.1.3 總黃酮的含量測(cè)定 精密吸取樣品溶液1 mL，按照上述2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)操作，測(cè)定野山杏總黃酮的吸光度，計(jì)算黃酮含量，平行測(cè)3次。

2.2 高脂乳劑的制作 按文獻(xiàn)方法[5]配制高脂乳劑(100 g·L-1膽固醇、200 g·L-1豬油、20 g·L-1膽酸鈉、10 g·L-1甲基硫氧嘧啶)。

2.3 分組與造模 SD雄性大鼠，正常對(duì)照組飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，高血脂組灌服高脂乳劑連續(xù)灌服4周，待血脂升高后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)[5]。

大鼠隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組，高脂血癥模型組，血脂康組(0.2 g·kg-1)和TFWA高低劑量組(0.2和0.4 g·kg-1)，每組10只大鼠，正常組對(duì)照組：飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，并按每天10 mL·kg-1灌服生理鹽水，高脂模型組：每天灌服高脂乳劑10 mL·kg-1，血脂康組：每天在灌服高脂乳劑10 mL·kg-1的基礎(chǔ)上灌服血脂康混懸液0.2 g·kg-1，TFWA低劑量組：每天在灌服高脂乳劑10 mL·kg-1的基礎(chǔ)上灌服TFWA0.2 g·kg-1，TFWA高劑量組：每天在灌服高脂乳劑10 mL·kg-1的基礎(chǔ)上灌服TFWA 0.4 g·kg-1，連續(xù)8周，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠每周稱體質(zhì)量1次，以便調(diào)整給予劑量，自由進(jìn)食，進(jìn)水。末次給藥后禁食12 h，不禁水。

2.4 血清脂質(zhì)測(cè)定 乙醚麻醉，心臟取血，血液靜置2 h后，以3 000 r·min-1離心20 min，及時(shí)分離血清。按照試劑盒方法[6]測(cè)定TC、TG、HDL-C和LDL-C水平。

2.5 肝臟組織勻漿過(guò)氧化和抗氧能力測(cè)定 采血后快速取出肝臟，生理鹽水洗凈，濾紙擦干后稱質(zhì)量并計(jì)算肝臟系數(shù)，肝臟系數(shù)=肝臟濕質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。摘取一定質(zhì)量的肝左葉組織，加入9倍體積的生理鹽水制成10%勻漿，測(cè)定肝組織MDA含量及SOD和GSH-PX活性。

3 結(jié)果與分析

3.1 野山杏總黃酮的含量 野山杏中總黃酮的含量平行測(cè)定3次，取其平均值，測(cè)定結(jié)果為269.7mg·g-1。

3.2 TFWA對(duì)大鼠體質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響 見(jiàn)表1。肝臟系數(shù)可反映肝臟受損傷程度。TFWA對(duì)大鼠體質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響結(jié)果如表1所示，各組大鼠的體質(zhì)量之間無(wú)差異(P>0.05)；高脂組大鼠的肝臟系數(shù)與正常對(duì)照組相比，呈極顯著差異(P<0.001)。TFWA高、低劑量組和血脂康組均可顯著降低肝臟系數(shù)(P<0.001)，表明血脂康可減輕肝臟的損傷。

表1 TFWA對(duì)大鼠體質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響

3.3 TFWA對(duì)大鼠血脂的影響 見(jiàn)表2。TFWA對(duì)大鼠血脂的影響結(jié)果如表2所示，與正常組相比，高脂組大鼠血清中TC、TG和LDL-C含量極顯著升高(P<0.001)，HDL-C顯著性降低(P<0.01)，表明大鼠高脂血癥模型誘導(dǎo)成功。TFWA高、低劑量組和血脂康組較高脂模型組能明顯降低TC含量(P<0.001)；TFWA低劑量組和血脂康組較高脂模型組可明顯降低TG含量(P<0.05)，TFWA高劑量組較高脂模型組能顯著降低TG含量(P<0.01)；TFWA高劑量組較高脂模型組能顯著降低LDL-C含量(P<0.01)；TFWA高劑量組較高脂模型組能明顯提高HDL-C含量(P<0.01)。

表2TFWA對(duì)大鼠血脂的影響

Tab.2 Effects of TFWA on serum contents of TC，TG，HDL-C，LDL-C in hyperlipidemia rats

注：與正常對(duì)照組相比△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；與高血脂模型組相比﹡P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3.4 TFWA對(duì)大鼠肝臟過(guò)氧化和抗氧化能力的影響 見(jiàn)表3。TFWA對(duì)大鼠肝臟過(guò)氧化和抗氧化能力的結(jié)果如表3所示，高脂血癥大鼠在血脂升高的同時(shí)，肝臟中的MDA含量也極顯著升高(P<0.001)，抗氧化酶SOD和GSH-Px活性明顯下降(P<0.05)。TFWA高劑量組可以明顯提高肝臟中SOD和GSH-Px活性(P<0.05)。對(duì)于肝臟中的MDA，TFWA高、低劑量組和血脂康組對(duì)其影響差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此說(shuō)明TFWA 可明顯抑制大鼠肝臟的脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，增強(qiáng)大鼠體內(nèi)SOD和GSH-Px的活性。

表3 TFWA對(duì)大鼠肝臟中SOD、MDA和GSH-Px的影響

4 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野山杏果肉中含有較多的黃酮類成分，總黃酮的含量高達(dá)269.7 mg·g-1。

黃酮類化合物是許多天然藥物的有效成分，由于天然來(lái)源的黃酮相對(duì)分子質(zhì)量小，能被人體迅速吸收，進(jìn)而體現(xiàn)出保護(hù)血管、消除疲勞、擴(kuò)張毛細(xì)血管、疏通微循環(huán)、防動(dòng)脈硬化、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大腦及其他組織臟器細(xì)胞的功能等[7]。

野山杏果肉總黃酮可明顯降低高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDL-C含量，顯著升高HDL-C含量，并顯著降低高脂血癥大鼠肝臟MDA水平，升高肝臟組織中SOD和GSH-Px活性，TFWA高低劑量組對(duì)MDA的抑制率分別達(dá)到了44%和38%，TFWA可明顯降低血脂和抑制肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，且其作用呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，這提示可能與抗氧化能力的提高和與脂質(zhì)代謝相關(guān)酶活性的增加以及脂肪生成的抑制等多方面的作用有關(guān)，而TFWA 體內(nèi)調(diào)節(jié)血脂代謝和抗氧化作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

氧應(yīng)激/脂質(zhì)過(guò)氧化作用在脂肪肝的形成機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。MDA為過(guò)氧化脂質(zhì)的十分重要的降解產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞及細(xì)胞成分具有一定的損傷作用，干擾脂肪酸的氧化降解，導(dǎo)致脂肪在肝內(nèi)的蓄積[8]。因此，MDA是自由基生成過(guò)多時(shí)脂質(zhì)反應(yīng)的產(chǎn)物，標(biāo)志著自由基活動(dòng)的活躍性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高脂對(duì)照組脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA顯著升高，抗氧化能力下降，證明大鼠脂肪肝及肝損傷有脂質(zhì)過(guò)氧化損害的參與。

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