腦缺血再灌注Na+—K+—ATPase損傷作用的實驗性治療初探

鄭新華　吳和平　孫銀銀　苑廣超

【摘要】 目的：探討尼莫地平和東莨菪堿治療腦缺血再灌注損傷的作用機理。方法：夾閉雙側頸總動脈和椎動脈復制腦完全性缺血模型。60只家兔均分成六組，假手術組、腦缺血組、腦缺血再灌注組、腦低溫治療組、東莨菪堿治療組、尼莫地平治療組。采集腦和血液標本測量Na+-K+-ATPase、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）活性。結果：缺血再灌注組腦組織SOD和Na+-K+-ATPase活性降低、MDA含量升高；相反，治療組SOD和Na+-K+-ATPase活性升高，MDA含量降低。結論：東莨菪堿和尼莫地平具有保護缺血再灌注組腦組織Na+-K+-ATPase活性的作用，其機理可能與它們抑制自由基介導的脂質過氧化，減少脂質過氧化物的生成有關。

【關鍵詞】 腦缺血再灌注； Na+-K+-ATP酶； 東莨菪堿； 尼莫地平

腦組織Na+-K+-ATPase對缺血再灌注損傷十分敏感[1]，這在腦復蘇領域中一直未引起足夠的重視。目前認為再灌注大量生成的自由基介導的膜脂質過氧化是腦缺血再灌注損傷的重要機制[2-4]。本研究試圖從這一角度，以頭部低溫為陽性對照，以東莨菪堿（莨菪堿類藥），尼莫地平（Ca2+拮抗劑）為代表藥，探討它們對腦缺血再灌注Na+-K+-ATPase損傷的作用及作用機理，并進一步為莨菪堿類藥和Ca2+拮抗劑防治腦缺血再灌注損傷提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗分組 大耳白兔（湖北省醫(yī)學實驗動物中心提供）60只，體重1.4～1.8 kg，雌雄不拘，實驗前禁食12 h，飲水不限，應用25%烏拉坦靜脈麻醉，機械通氣；監(jiān)測血氣，維持PaCO2于4.32～5.47 kPa。動物均分為六組。假手術組：只做相應的操作，未夾閉血管，不造成缺血再灌注過程；腦缺血組：假手術組+腦缺血30 min；腦缺血再灌注組：腦缺血組+再灌注90 min；腦低溫治療組：腦缺血再灌注+腦低溫，即再灌注開始由蠕動泵5 mL/（kg·min）輸入經(jīng)“體外血液降溫系統(tǒng)”冷卻的血液，再灌注期間（90 min）保持腦溫在（26±0.25）℃；東莨菪堿治療組：腦缺血再灌注組+東莨菪堿，即再灌注開始靜脈注射東莨菪堿（廣州僑光制藥廠）0.2 mg/kg；尼莫地平治療組：腦缺血再灌注組+尼莫地平，即再灌注開始靜脈注射尼莫地平（西德 Bayer Leverkusen 公司生產(chǎn)）60 μg/kg。

各組動物實驗期間保持直腸溫度在37～38 ℃。再灌注期間平均動脈壓維持平均在（11.24±0.25）kPa（與實驗前的差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05）。

1.2 腦完全性缺血模型復制 四血管式（夾閉雙側頸總動脈和椎動脈）+低血壓法[平均動脈壓降至（5.45±0.21）kPa][5-6]。

1.3 選擇性腦低溫法 按照文獻[7]建立自左股動脈、左頸總動脈近心端經(jīng)蠕動泵、冰水槽至左頸總動脈遠心端的“體外血液降溫系統(tǒng)”。在枕葉顱骨鉆一小孔，置入針樣熱敏探頭監(jiān)測腦溫。

1.4 標本采集及測量方法 除腦缺血組外（缺血30 min末），其余組在再灌注90 min末（假手術組相應于再灌注90 min末的時間），在動物存活下取適量枕頂皮層，放入液氮中保存，在冰浴下制成腦勻漿并參照文獻[8]測量Na+-K+-ATPase活性，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA），測量方法同文獻[5-6]。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)用（x±s）表示，組間均數(shù)差異顯著性檢驗用t檢驗法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腦組織Na+-K+-ATPase活性 以腦缺血再灌注組最低，腦低溫治療組、東莨菪堿治療組和尼莫地平治療組的Na+-K+-ATPase活性顯著高于腦缺血再灌注組（P分別<0.05和<0.01），與假手術組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；腦低溫治療組、東莨菪堿組和尼莫地平治療組三組間的Na+-K+-ATPase活性差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；見表1。

2.2 腦組織SOD活性 3個治療組（腦低溫治療組、東莨菪堿治療組、尼莫地平治療組）的SOD活性接近假手術組，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；高于腦缺血組和腦缺血再灌注組，但與腦缺血組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與腦缺血再灌注組差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

2.3 腦組織MDA含量 以腦缺血再灌注組最高，腦缺血組次之，但腦缺血組與除腦缺血再灌注組外的其他組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；腦缺血再灌注組與除腦缺血組外的其他組間差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；腦低溫治療組、東莨菪堿治療組、尼莫地平治療組的MDA含量變化與假手術組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3 討論

大量研究證實氧自由基是缺血再灌注損傷的物質基礎和啟動因子，其介導的膜脂質過氧化而引起生物膜結構破壞﹑功能受損等改變被認為是腦缺血再灌注損傷的重要機制。自由基的結構不穩(wěn)定，壽命僅幾微秒至百分之幾秒，直接檢測目前較困難。因此本實驗與眾多文獻一樣用測量SOD活性和MDA含量間接反映機體清除自由基能力和脂質過氧化程度。

低溫[9]﹑莨菪堿類藥[5-6]﹑Ca2+拮抗劑均有保護SOD活性[10]﹑抑制自由基介導的脂質過氧化等作用而減輕或改善腦缺血再灌注損傷。研究表明低溫還有保護缺血再灌注腦組織Na+-K+-ATPasee的作用[7]。本實驗表明東莨菪堿和尼莫地平同低溫一樣也有保護再灌注腦組織Na+-K+-ATPase活性的作用。

腦Na+-K+-ATPase是位于腦細胞膜上的一種大分子蛋白質，其對缺血再灌注損傷十分敏感的機理還未有深入研究的報道。研究表明磷脂腺絲氨酸和磷脂腺肌醇以及脂肪酸的不飽和程度和鏈長均影響著Na+-K+-ATPase活性[11-12]。自由基攻擊的靶位是不飽和脂肪酸，而人體內的不飽和脂肪酸主要位于生物膜中。顯然，Na+-K+-ATPase的這些特性易遭受自由基損害。Sugawara[13]認為再灌注Na+-K+-ATPase損傷的機理可能主要與自由基介導的脂質過氧化物直接抑制酶活性有關。再灌注自由基大量生成的機制主要與黃嘌呤氧化酶有關；Marro[14]研究證實，黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇能保護缺氧乳豬腦細胞膜Na+-K+-ATPase活性。Pierr[15]的研究表明，自由基清除劑EGP761能預防腦缺血鼠Na+-K+-ATPase損傷。也有觀點認為NO也是一種自由基[16]，它還可以生成毒性更強的OH-和NO2-，引起蛋白質酪氨酸硝基化反應且使脂質過氧化程度加重，進一步破壞DNA，還可使一些重要酶失活，細胞能量代謝障礙，還參與細胞凋亡的信號通路，加重腦缺血再灌注損傷。但Groenendaal[17]給予NO合成酶抑制劑NNLA未能保護乳豬腦細胞膜Na+-K+-ATPase活性。本實驗結果還顯示，SOD活性降低，MDA含量升高，Na+-K+-ATPase活性下降，反之，SOD活性升高，MDA含量下降，Na+-K+-ATPase活性升高。提示缺血再灌注腦組織Na+-K+-ATPase損傷與自由基和脂質過氧化含量緊密相關；東莨菪堿和尼莫地平保護缺血再灌注組腦組織Na+-K+-ATPase活性作用的機理可能與它們保護了缺血再灌注時內源性SOD活性，提高機體清除自由基的能力，抑制自由基介導的脂質過氧化作用，減少脂質過氧化物的生成有關。

參考文獻

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（收稿日期：2014-05-22） （本文編輯：郎威）

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（收稿日期：2014-05-22） （本文編輯：郎威）

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（收稿日期：2014-05-22） （本文編輯：郎威）