鹿角靈芝提取三萜酸的研究

李靜， 鄧毛程， 王瑤， 陳維新

(廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 廣州510300)

鹿角靈芝提取三萜酸的研究

李靜， 鄧毛程， 王瑤， 陳維新

(廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 廣州510300)

為了高值化利用鹿角靈芝，初步研究了乙醇浸提法提取三萜酸的工藝條件。通過單因素試驗和正交試驗，確定了最佳的浸提條件：液固比30∶1，溫度90 ℃，時間120 min，乙醇濃度70%(v/v)。在最佳條件下進(jìn)行驗證試驗，靈芝酸A和靈芝酸B的總提取率達(dá)到0.536‰。

三萜酸；鹿角靈芝；靈芝酸A；靈芝酸B；乙醇浸提

引言

鹿角靈芝為擔(dān)子綱多孔菌科靈芝屬真菌，學(xué)名Ganodermaamboinense(Lam. Fr.)Pat，因其形狀似鹿角而得名[1]，主要產(chǎn)于我國海南、云南等地區(qū)。靈芝具有抗腫瘤、抗氧化活性和增強免疫力的功能，其應(yīng)用在我國具有悠久的歷史，被我國第一部藥學(xué)著作《神農(nóng)本草經(jīng)》視為滋補強壯、扶正固本的珍品[2]。近年來，鹿角靈芝備受重視，在化學(xué)、藥理和臨床等領(lǐng)域均有大量研究，研究表明其具有調(diào)節(jié)免疫、保肝、抗腫瘤和抗衰老等多種活性[3-4]。

三萜類化合物是靈芝的主要活性成分之一，多數(shù)三萜類化合物由30個碳原子組成，是由6個異戊二烯結(jié)構(gòu)單元聯(lián)結(jié)而成的化合物[5]。三萜類化合物結(jié)構(gòu)類型豐富，以四環(huán)三萜和五環(huán)三萜為主，極少數(shù)是無環(huán)三萜、二環(huán)三萜及三環(huán)三萜[6]。近年來，藥理研究表明其具有護(hù)肝排毒、抗氧化、抗菌降糖、抗HIV病毒和皰疹病毒、抑制腫瘤細(xì)胞等作用[6-8]。20世紀(jì)80年代至今，許多研究者已對靈芝的多糖物質(zhì)和三萜類物質(zhì)的提取純化工藝進(jìn)行了大量研究[1-2,9-11]。但是，極少見有鹿角靈芝三萜酸提取的報道。因此，本文采用乙醇浸提法對鹿角靈芝的三萜酸提取進(jìn)行了初步研究，可為鹿角靈芝的開發(fā)利用提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1材料

鹿角靈芝：成熟、新鮮的農(nóng)產(chǎn)品，購自海南??；靈芝酸A、靈芝酸B：分析純，購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；無水乙醇等：均為分析純，市售。

1.2三萜類化合物的浸提方法

浸提流程：原料→干燥→粉碎→過篩→乙醇回流浸提→離心分離→浸提液。具體操作是：首先，將鹿角靈芝原料置于100 ℃下干燥至恒重，再經(jīng)粉碎、100目篩分離，獲取100目以下的粉末；然后，將鹿角靈芝粉末與乙醇溶液混合，置于平底燒瓶中進(jìn)行恒溫回流浸提，再采用離心機于8000 r/min進(jìn)行離心分離，可獲取三萜類化合物的浸提液，備用。

1.3乙醇濃度對提取率的影響

分別采用不同濃度的乙醇溶液作為浸提溶劑，按30∶1的液固比與鹿角靈芝粉末混合，于100 ℃下回流浸提120 min，優(yōu)選乙醇溶液的濃度。

1.4溫度對提取率的影響

以70%(v/v)的乙醇溶液為浸提溶劑，按30∶1的液固比與鹿角靈芝粉末混合，置于不同溫度下進(jìn)行回流浸提120 min，優(yōu)選浸提的溫度。

1.5液固比對提取率的影響

以70%(v/v)的乙醇溶液為浸提溶劑，按不同液固比與鹿角靈芝粉末混合，于100 ℃下進(jìn)行回流浸提120 min，優(yōu)選浸提的液固比。

1.6時間對提取率的影響

以70%(v/v)的乙醇溶液為浸提溶劑，按30∶1的液固比與鹿角靈芝粉末混合，于100 ℃下進(jìn)行回流浸提，采用不同浸提時間進(jìn)行試驗，優(yōu)選浸提的時間。

1.7正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，再對乙醇濃度、溫度、液固比、時間進(jìn)行四因素三水平正交試驗。

1.8三萜酸測定與提取率計算

靈芝酸A和靈芝酸B是Kutoba等1982年首次從靈芝中分離得到的三萜類物質(zhì)[12]，也是靈芝中含量較高的三萜類成分，故選擇靈芝酸A和靈芝酸B為鹿角靈芝三萜酸提取物的檢測成分。參照文獻(xiàn)[13]的HPLC檢測方法，以靈芝酸A和靈芝酸B的甲醇溶液為對照品，采用島津LC-20AT高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。樣品預(yù)處理：采用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀將提取液樣品蒸發(fā)至干，用甲醇溶解殘渣，配制成溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。色譜條件：色譜柱為Inertsil ODS-SP(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測靈芝酸A的流動相位乙腈-0.01%磷酸水溶液(乙腈：0.01%磷酸水溶液=35∶65)；檢測靈芝酸B的流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(乙腈：0.1%磷酸水溶液=30∶70)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為255 nm；柱溫為22 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL。

以靈芝酸A和靈芝酸B的含量總和計算鹿角靈芝三萜酸的提取率，計算式為：

提取率=

2 結(jié)果與分析

2.1乙醇濃度對提取率的影響

在不同乙醇濃度的條件下，三萜酸的提取率如圖1所示。從圖1可以看出，60%～80%的乙醇溶液有利于靈芝酸A和靈芝酸B的浸提，在此范圍內(nèi)的提取率較高，其中乙醇濃度為70%時的提取率達(dá)到最高。

圖1 不同乙醇濃度下的提取率

2.2溫度對提取率的影響

在不同溫度下，三萜酸的提取率如圖2所示。升高浸提溫度，可使物料處于沸騰狀態(tài)，有利于原料與溶劑的充分接觸；同時，可促進(jìn)分子運動，有利于溶質(zhì)與溶劑的相互滲透。從圖2可以看出，在較低溫度范圍內(nèi)，提取率隨溫度升高而增大；在85-95 ℃的溫度范圍內(nèi)，三萜酸的提取率較高，其中溫度為90 ℃時的提取率最高；當(dāng)溫度超過90 ℃時，提取率反而略有下降，可能因溫度過高使某些成分損失。

圖2 不同溫度下的提取率

2.3液固比對提取率的影響

在不同液固比下，三萜酸的提取率如圖3所示。增大液固比的增大，可使原料濃度降低，有利于原料中目標(biāo)成分充分的浸提。從圖3可以看出，隨著液固比的增大，三萜酸的提取率呈上升趨勢；液固比達(dá)到30∶1時，繼續(xù)增大液固比，提取率變化十分平緩。從節(jié)約溶劑考慮，最適宜的液固比可選取30∶1。

圖3 不同液固比下的提取率

2.4時間對提取率的影響

在不同時間下，三萜酸的提取率如圖4所示。由于分子擴散、溶解需要一定時間，為了使靈芝酸A和靈芝酸B被充分浸提出來，應(yīng)保證足夠的浸提時間；但是，如果浸提的時間過長，可能會導(dǎo)致某些成分受熱損失。結(jié)果表明，浸提的時間為120 min時，三萜酸的提取率達(dá)到最高。

圖4 不同時間下的提取率

2.5正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，正交試驗設(shè)計見表1。在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇合理的因素水平進(jìn)行正交試驗，正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。由表2直觀分析可知，極差最大的是C因素，對三萜酸提取率的影響排序是：C>B>D>A。方差分析結(jié)果表明，對于三萜酸的提取率，因素C具有非常顯著性的影響，因素B具有顯著性的影響，因素D具有不顯著的影響。最終確定對三萜酸浸提的最佳條件是C2B2D3A2，即：液固比為30∶1，溫度為90 ℃，時間為120 min，乙醇濃度為70%(v/v)。在最佳條件下進(jìn)行驗證試驗，三萜酸的提取率為0.536‰。

表1 因素與水平

3 結(jié)束語

乙醇濃度、溫度、液固比和時間對鹿角靈芝三萜酸的提取率均有影響。通過單因素試驗和正交試驗，確定最佳的浸提條件為：液固比30∶1，溫度90 ℃，時間120 min，乙醇濃度70%(v/v)。在最佳條件下進(jìn)行驗證試驗，靈芝酸A和靈芝酸B的總提取率達(dá)到0.536‰。本文對于鹿角靈芝三萜酸的提取工藝條件的進(jìn)一步研具有一定的參考價值。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

[1] 覃海元,潘嫣麗,覃梅珍.熱水與超聲波提取鹿角靈芝多糖工藝比較研究[J].中國食品添加劑,2011(3):91-95.

[2] 胡斌杰,陳金鋒,王宮南.超聲波法與傳統(tǒng)熱水法提取靈芝多糖的比較研究[J].食品工業(yè)科技,2007(2):190-192.

[3] 劉研新,余 彥,王 蓓,等.鹿角靈芝膠囊的抗腫瘤活性及對順鉑所致腎損傷的保護(hù)作用[J].華西藥學(xué)雜志,2008,23(5):564-566.

[4] 賀玉琢．鹿角靈芝的抗癌作用及放射線防護(hù)作用[J].國外醫(yī)學(xué):中醫(yī)中藥分冊,2005,27(4):245-255.

[5] 蒙麗麗,黃初升,劉紅星.具有生物活性的天然三萜化合物的研究進(jìn)展[J].廣西植物,2008,28(6):856-860.

[6] 孫常松,李瑪琳.五環(huán)三萜類化合物抗腫瘤活性及其機制研究進(jìn)展[J].中國民族民間醫(yī)藥,2009,12:14-16.

[7] 張 園,張信文,陳光英.五環(huán)三萜類化合物抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].海南師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2011,24(1):92-95.

[8] 宋長城,朱美玲.中藥所含三萜類化合物抗腫瘤活性及其作用機制的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2011,19(9):1180-1183.

[9] 袁 媛,楊 毅,開桂青,等.靈芝三萜提取工藝研究[J].安徽化工,2007,33(4):27-29.

[10] 吳建國,王敏慧,吳巖斌,等.硬孔靈芝三萜酸提取工藝研究[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2011,21(5):32-34.

[11] 劉晶晶,章晉武,徐培娟.超臨界CO2萃取靈芝孢子油中三萜類化合物[J].食品研究與開發(fā),2009,30(9):56-58.

[12] Kubota T,Asaka Y,Miura I,et a1.Structures of ganodetic acid A and B,two new lanostane type bitter triterpenes from Ganoderma lucidum (Fr.) Karst[J].Helvetica Chimica Acta,l982,65(2):611-619.

[13] 盧端萍,陳 碩,王 勇,等.HPLC測定赤芝水提取物中靈芝酸A含量[J].中國現(xiàn)代中藥,2013,15(6):496-499.

Study on the Extractive Technique of Triterpenic Acid FromGanodermaAmboinense

LIJing,DENGMaocheng,WANGYao,CHENWeixin

(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300, China)

In order to achieve the high-valued utilization ofGanodermaamboinense, the preliminary study about conditions of extractive technique of triterpenic acid by ethanol reflux is developed. Using the single factor experiment and orthogonal design experiment respectively, the optimum conditions are determined as follows: liquid-solid ratio of 30, extracting temperature of 90 ℃, extracting time of 120min and ethanol concentration of 70% (v/v). Under the optimum conditions, the total extraction rate of Ganoderic acid A and Ganoderic acid B can reach 0.536‰.

triterpenic acid;Ganodermaamboinense; Ganoderic acid A; Ganoderic acid B; ethanol reflux

2014-06-15

廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心建設(shè)項目(GCZX-B1103)；廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院自然科學(xué)啟動基金(KJ201207)

李 靜(1974-)，女，湖北武漢人，副教授，碩士，主要從事環(huán)境微生物、食品資源綜合利用方面的研究，(E-mail)eeslee2005@163.com

1673-1549(2014)06-0009-04

10.11863/j.suse.2014.06.03

R284.2

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