傳代細(xì)胞系的支原體污染的檢測與去除

夏晴

(上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 上海 200030)

傳代細(xì)胞株在培養(yǎng)過程中容易感染支原體。感染后細(xì)胞不會馬上死亡或出現(xiàn)形態(tài)變化,有些細(xì)胞甚至一點(diǎn)變化都沒有,所以往往被研究者忽視[1]。支原體對一般抗生素不敏感,所以污染后去除麻煩。快速高效的檢出支原體無論在科學(xué)研究還是實(shí)際生產(chǎn)中都具有重要意義。

1 支原體污染的檢測方法

1.1 培養(yǎng)法[2-3]

此法是將待測細(xì)胞株的上清液接入特定液體培養(yǎng)基,經(jīng)過4-7天的37℃培養(yǎng),根據(jù)培養(yǎng)基PH值的變化來判定結(jié)果。但因培養(yǎng)基PH值受內(nèi)外干擾較多,仍需進(jìn)行第二步培養(yǎng),即將上步培養(yǎng)液接入固體培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)。如果確有支原體污染則會有典型的“荷包蛋”式菌落長出。

1.2 DNA染色法[2-3]

DNA染色法具有直觀、高靈敏度、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。首先將指示細(xì)胞Vero接種到24孔中,培養(yǎng)1天后在每個孔中接種待測樣品。培養(yǎng)4天。然后經(jīng)過固定、染色、封片等步驟,并用熒光顯微鏡觀察,最終判定結(jié)果。被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后,在熒光顯微鏡下除了看到有細(xì)胞核以外,在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍還可以看到許多大小均一的熒光小點(diǎn),即為支原體的DNA,證明有支原體污染。

有些人將這種方法變化,比如直接染色待測細(xì)胞等等,但原理都是利用熒光染液結(jié)合A-Trich區(qū)域的特性。盡管染色直觀,利用指示細(xì)胞培養(yǎng)可以滿足支原體生長的復(fù)雜營養(yǎng)要求,操作簡單,但檢驗(yàn)周期仍需要5天時間,雖然比培養(yǎng)法的檢驗(yàn)時間大大縮短,但仍不能滿足生產(chǎn)和科研的及時監(jiān)測要求。另外,DNA染色法最大的弊端在于所污染的支原體必須屬于DNA中A-Trich的種屬,對于精氨酸類的支原體污染檢出效果不佳,要結(jié)合培養(yǎng)法才確保結(jié)果準(zhǔn)確。

1.3 PCR[4-5]

PCR方法檢測支原體,首先要把待測細(xì)胞裂解,去除抑制物。根據(jù)常見污染細(xì)胞的支原體的保守序列16S rRNA設(shè)計引物,經(jīng)過合適的PCR反應(yīng)程序后,電泳,判定最終結(jié)果。PCR檢測的最大優(yōu)點(diǎn)是快捷,通常2小時左右即可得出結(jié)果。

目前基于PCR檢測的研究主要集中在如何更好去除抑制物、設(shè)計引物、優(yōu)化PCR程序等。此種方法主要問題在于容易造成假陰性和假陽性結(jié)果,對于重要樣品的結(jié)果判定還需依賴于培養(yǎng)法和DNA染色法。所以到目前為止,筆者仍未看到類似藥典之類的官方檢測方法收錄PCR方法。

2 支原體污染的去除方法[6-8]

一般情況下,一經(jīng)發(fā)現(xiàn)有支原體污染,最好是及時滅活丟棄。但對于一些珍貴細(xì)胞系等被污染后還應(yīng)難免會考慮將支原體清除。以下列舉了最常用的三種方法。另有其它的去除方法幾乎都是在下面三種方法基礎(chǔ)上的改良和疊加。

2.1 抗生素處理法

抗生素處理目前是最有效、實(shí)驗(yàn)室最常用的一種方法。由于支原體沒有細(xì)胞壁,所以培養(yǎng)細(xì)胞時通常加入的那些抗生素如青鏈霉素等對其殺傷效果不大。目前市場針對支原體污染的抗生素主要有BM-cyclin、MC-210、Ciprofloxacin、M-lasmocin等。用抗生素處理污染的細(xì)胞株時會出現(xiàn)一些問題。如處理周期比較長,如BM-cycling整個處理時間需要21天,處理過程中細(xì)胞要進(jìn)行傳代,這對于那些有限細(xì)胞系來說就要謹(jǐn)慎處理了。經(jīng)使用MC-210處理只需要7天時間,但有一定的復(fù)發(fā)率。Ciprofloxacin等相對毒性較大,對細(xì)胞損害較大。

2.2 加溫處理法

支原體在56℃條件下,30秒內(nèi)半數(shù)死亡,在45℃環(huán)境中,l5-30分鐘內(nèi)全部死亡。將污染了的細(xì)胞培養(yǎng)物在41℃持續(xù)加溫,依據(jù)支原體種類的不同,加溫時間亦有所不同,直至支原體死亡,培養(yǎng)細(xì)胞雖也會發(fā)生形態(tài)的變化,但降到正常溫度后可復(fù)原。尤其對于普通蛋制苗中支原體污染是一個簡便易行的方法。

2.3 巨噬細(xì)胞吞噬法

此法適用于救治支原體嚴(yán)重污染的各種珍貴細(xì)胞株,一般經(jīng)過連續(xù)幾輪的巨噬細(xì)胞吞噬處理后,即可消除污染并恢復(fù)細(xì)胞活力。但由于要經(jīng)過小鼠腹腔,所以有帶入鼠類病毒污染的可能性。

3 展望

如今,體外傳代細(xì)胞株的培養(yǎng)在生物學(xué)的生產(chǎn)和科研領(lǐng)域扮演著極其重要的角色。然而細(xì)胞株被支原體污染后難以及時察覺,容易給生產(chǎn)和科研帶來嚴(yán)重?fù)p失。支原體污染的檢測方法既要滿足準(zhǔn)確的要求又要即可能的縮短檢測時間。而對于已污染的珍貴細(xì)胞株,要選取一種既可靠又便捷的方式來處理。

[1]劉玉琴.體外培養(yǎng)細(xì)胞工作中支原體污染及對策[J].中華病理學(xué)雜志,2004,33(6):571-572.

[2]吳清壇,蒲榮.固體與液體培養(yǎng)法在鑒別支原體感染的差異性研究[J].醫(yī)學(xué)檢驗(yàn),2011,8(6):69-71.

[3]趙俊,王興滿,胡勇,陳敬賢,王明麗.動物細(xì)胞培養(yǎng)物中支原體污染的檢測[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(3):1151-1153.

[4]甘一迪,王銀銀,任芳麗,張旭,田碩,張誠.培養(yǎng)細(xì)胞污染支原體的PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù),2011,6(4):295-298.

[5]張貴剛,劉艷霞.細(xì)胞培養(yǎng)中支原體PCR檢測進(jìn)展[J].動物傳染病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生,2008學(xué)術(shù)年會:313-316.

[6]劉嵐等.貼壁細(xì)胞培養(yǎng)過程中支原體污染的幾種救治方案療效比較研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2008,24(8):1221-1222.

[7]杜金玲等.生物制品中支原體污染及清除方法的研究進(jìn)展[J],2012,46(2):57-60.

[8]高林等.用乙基環(huán)丙沙星重建受豬鼻支原體污染的BHK-21細(xì)胞的研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(12):45-49.