色譜法在藥物分析中的應(yīng)用

沈愛平

(黃岡職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生學(xué)院，湖北黃岡438002)

色譜法 (chromatography)是一種物理或物理化學(xué)分離分析方法，是將混合物中各組分分離后在線或離線分析的方法，是現(xiàn)代分離分析的一個重要方法。1901年，俄國植物學(xué)家茨維特首先認識到色譜法在分離分析方面的重要價值，并于1903年首先應(yīng)用色譜法分離植物葉片中的各種色素。色譜法利用不同物質(zhì)在固定相和流動相中具有不同的分配系數(shù)，當(dāng)兩相作相對移動時，這些物質(zhì)在兩相間進行反復(fù)多次分配，原來微小的分配差異產(chǎn)生了很明顯的分離效果，從而依先后順序流出色譜柱，通過適當(dāng)?shù)臋z測手段對分離后的各組分進行測定。色譜法具有高靈敏度、高選擇性、高效能、分析速度快及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點，是分析混合物的最有效手段。色譜法被廣泛用于藥品的鑒別、純度檢查和含量測定。

藥物分析則是分析化學(xué)在藥物研發(fā)領(lǐng)域中的應(yīng)用分支。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，沒有藥物分析就沒有新藥的發(fā)現(xiàn)［1］。該學(xué)科涉及的研究范圍包括藥物質(zhì)量控制、臨床藥學(xué)、中藥與天然藥物分析、藥物代謝分析、法醫(yī)毒物分析、興奮劑檢測和藥物制劑分析、創(chuàng)新藥物研究，以及藥品上市后的評價等［2］。

1 薄層色譜法(Thin layer chromatography，TLC)

薄層色譜法(Thin layer chromatography，TLC)是將供試品溶液點樣于涂布有固定相的薄層板上，經(jīng)展開、檢視后所得的譜圖，與適宜的對照品按同法操作所得的色譜圖進行比較，主要用于藥品的鑒別及藥品中雜質(zhì)的檢測［3］。薄層色譜法操作方便，分離效率高，專屬性好，分析速度快，各國藥典中均有多種藥物采用TLC法來檢查有關(guān)物質(zhì)以保證藥品的純度。近年來，盡管其他色譜技術(shù)發(fā)展迅速，但薄層色譜的應(yīng)用并沒有明顯減少［4］。

薄層色譜法可根據(jù)藥物中雜質(zhì)的不同情況，可采用不同的方法進行檢查［5］:若雜質(zhì)已知，則可采用雜質(zhì)對照品法進行檢查;若雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)不能確定或無雜質(zhì)的對照品，則可采用高低濃度對比法。畢雪艷［6］等采用薄層色譜法檢測復(fù)方氨酚烷胺顆粒中有關(guān)物質(zhì)(對氯苯乙酰胺)，以硅膠 GF254為固定相，以0.5% 的羧甲基纖維素鈉溶液為粘合劑，展開劑為氯仿－丙酮－甲苯(13∶5∶2)。該法測得的對氯苯乙酰胺最小檢出量為0.2 μg。張尊聽等［7］建立了新型內(nèi)標法以大豆甙元為內(nèi)標物測定葛根素注射液、中藥葛根及中成藥玉泉丸中葛根素的含量，試驗以甲醇－乙酸乙酯－石油醚－水(1.8∶6.0 ∶4.0 ∶0.35)為展開劑，測定結(jié)果準確，平均回收率為98.99%，RSD小于1.78%。

薄層色譜法優(yōu)點:1.展開時間短，一般十至幾十分鐘。2.分離能力強，斑點集中。3.靈敏度高，通常幾至幾十微克的物質(zhì)即可被檢出。4.顯色方便，可直接噴灑腐蝕性的顯色劑，如濃硫酸等。5.所用儀器簡單，操作方便，可以普及。6.薄層板價格低廉，一塊板可同時檢測多個樣品。7.色譜直觀性強。具有操作方便，設(shè)備簡單，分離效率高，專屬性好，分析速度快，色譜參數(shù)易調(diào)整等特點，在藥物分析中應(yīng)用較為廣泛。

2 氣相色譜法(Gas chromatatography，GC)

氣相色譜法(Gas chromatatography，GC)是1952年創(chuàng)立的一種以氣體為流動相的柱色譜法，是采用氣體流動相(載氣)流經(jīng)裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。物質(zhì)或其衍生物氣化后，被載氣帶入色譜柱進行分離，各組分先后進入檢測器，用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。由于氣體粘度小，組分擴散速率高，傳質(zhì)快，采用高靈敏度的通用型檢測器，使得氣相色譜法具有選擇性好、柱效高、靈敏度高、樣品用量少、分析速度快等特點，但受樣品蒸汽壓限制，不適用于難揮發(fā)和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)的分析。

李成等［8］建立氣相色譜法測定復(fù)方達克羅寧薄荷腦潤膚止癢水中薄荷腦含量，薄荷腦質(zhì)量濃度線性范圍為 0.3356 － 1.678 g/L。賀煥華等［9］建立的毛細管氣相色譜法測定鹽酸頭孢吡肟中N－甲基吡咯烷雜質(zhì)含量，N－甲基吡咯烷濃度在1.1213－134.56 μg/mL時線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.99998，RSD=0.00486%，加樣回收率 101.73%，檢測限 0.6 ng。劉敏等［10］采用 DB －17(30 m×0.53 mm，1μm)毛細管色譜柱建立毛細管氣相色譜法直接測定撲米酮片中撲米酮的含量，撲米酮在0.096～4.8 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 7)，平均回收率為 98.7%。

氣相色譜法優(yōu)點是:1.應(yīng)用范圍廣，能分析氣體、液體和固體。2.靈敏度高:可測定痕量物質(zhì)，進樣量可在1mg以下，一般氣體樣量為幾毫升，液體樣用幾微升或幾十微升?？勺鞒儦怏w、高分子單體的痕跡量雜質(zhì)分析和空氣中微量毒物的分析。3.選擇性高:可有效地分離性質(zhì)極為相近的各種同分異構(gòu)體和各種同位素。4.效能高:可把組分復(fù)雜的樣品分離成單組分。5.速度快:一般分析，只需幾分鐘即可完成，有利于指導(dǎo)和控制生產(chǎn)。6.應(yīng)用范圍廣:即可分析低含量的氣、液體，亦可分析高含量的氣、液體，可不受組分含量的限制。

3 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)

高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)高效液相色譜是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種在線分離分析方法，采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。具有分離效能高、分析速度快、靈敏度高，選擇性好和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。它結(jié)合了液相色譜法和氣相色譜法的分析分離原理，并且可以直接用于分析難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定及高分子樣品，彌補了氣相色譜法的弱點，擴大了色譜法的應(yīng)用范圍。由于HPLC方法的諸多優(yōu)點，使得該方法稱為中國藥典所有分析方法中發(fā)展最快的一種分析方法。由1985年版剛規(guī)定使用時的8個品種，發(fā)展到2000版藥典的282個品種。高效液相色譜法包括吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法和分子排阻色譜法，其中基于分配機理的高效液相色譜法在藥品檢驗中應(yīng)用非常廣泛的一種儀器分析方法。

朱莉萍等［11］建立高效液相色譜－熒光法(HPLC－FLD)檢測豬肉中兩種氟喹諾酮類藥物，采用 ZORBAX－SB－C18 色譜柱，以乙腈、0.01 mol/L磷酸二氫鈉(磷酸調(diào) pH 3)為流動相，檢測波長280 nm，發(fā)射波長450 nm。本方法測定動物組織中的恩諾沙星、環(huán)丙沙星的殘留，檢測條件穩(wěn)定，加標回收率高，系數(shù)較小，可操作性強，應(yīng)用簡單方便。林祖武［12］建立了HPLC法測定苦參洗劑中苦參堿含量，苦參堿的進樣量在0.12－2 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系，平均回收率為98.03%，RSD為 1.36%，方法簡便可行準確，且可操作性好。趙軍等［13］建立了反相高效液相色譜法同時分離測定6種臨床最常用的頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢噻肟)，采用 SHIM－PACK VP－ODS(150×4.6mm I.D.)色譜柱，以乙腈及 0.05 mol/L HAC－NaAC緩沖溶液(pH=4.0)組成流動相梯度淋洗，在 15 min內(nèi)分離并測定了上述6種頭孢菌素，6種藥物最低檢出限均可達到 0.20 μg/mL。

高效液相色譜法主要優(yōu)點是:1.分辨率高于其它色譜法。2.速度快，十幾分鐘到幾十分鐘可完成。3.重復(fù)性高。4.高效相色譜柱可反復(fù)使用。5.自動化操作，分析精確度高。

4 色譜聯(lián)用技術(shù)

4.1 色譜－質(zhì)譜聯(lián)用

色譜－質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合了色譜高分離能力和質(zhì)譜高靈敏度、極強的定性專屬特異性于一體，使樣品的分離、定性及定量成為連續(xù)的過程，是一種高效能、高選擇性、高靈敏度的分離分析方法。在藥物分析中的應(yīng)用越來越廣泛。色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分為氣相色譜－質(zhì)譜法(gas chromatography－mass spectrometry，GC－MS)和液相色譜－質(zhì)譜法(liquid chromatography－mass spectrometry，LC－MS)。GCMS對可揮發(fā)性未知成分與微量成分的結(jié)構(gòu)分析具有明顯優(yōu)勢。但是由于GC法的局限性，使得GCMS難以用于極性、熱不穩(wěn)定和大分子化合物的測定。陳琴華等［14］不僅分析了 GC－MS靈敏度的影響因素，還通過大量的文獻總結(jié)了 GC－MS在體內(nèi)化學(xué)藥物分析、濫用藥物分析及興奮劑檢測中的應(yīng)用。

朱全紅等［15］建立 GC－MS測定6名健康志愿者單次口服麻黃湯后尿液中麻黃堿類代謝產(chǎn)物的濃度，去甲偽麻黃堿(NMP)、去甲麻黃堿(NME)、麻黃堿(E)、偽麻黃堿(PE)和甲基麻黃堿(ME)在24h內(nèi)達到良好分離，5種麻黃生物堿的回收率均在88.74%－102.70%之間，日內(nèi)和日間精密度均≤10%。陳吉漢等［16］建立了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC－MS)測定雞肉與雞蛋中6種他汀類藥物殘留量。色譜柱為 BEH C18，以甲醇－0.1%甲酸5mmol乙酸銨為流動相，梯度洗脫分離，6 種他汀類藥物在 1.0－100 μg/kg濃度范圍內(nèi)線性良好，r＞0.9910，檢出限和定量限分別為 0.1－0.5 μg/kg 和 0.3－2.0 μg/kg。實際上，聯(lián)用技術(shù)還帶來許多無形的利益，包括減低成本?，F(xiàn)代GC/MS的分離度和分析速度、靈敏度、專屬性和通用性，至今仍是其他聯(lián)用技術(shù)難以達到的。因此，只要待測成分適用于GC分離，GC/MS就成為聯(lián)用技術(shù)中首選的分析方法。

4.2 色譜－核磁共振波譜聯(lián)用

液相色譜－核磁共振聯(lián)用(LC－NMR)出現(xiàn)于1978年，是快速分離、確定結(jié)構(gòu)的強有力的藥物分析手段?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于有機小分子藥物的鑒別定量，生物大分子類生化藥物的結(jié)構(gòu)研究、藥物的體外評價與研究及體內(nèi)藥物的監(jiān)控與研究等。

王映紅等［17］用停止流動的方法，對混合物的各個組分進行分離，并獲得1H NMR及COSY譜，建立了用高效液相－核磁共振聯(lián)用技術(shù)(HPLCNMR)檢測微量級蛇葡萄根提取物中混合組分結(jié)構(gòu)的方法，通過與此類化合物所建立的氫譜數(shù)據(jù)庫進行比較分析，確定了微克級的天然產(chǎn)物混合物中的主要組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)及立體結(jié)構(gòu)，使微量天然混合物中的主要組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)及立體結(jié)構(gòu)得到證實，充分體現(xiàn)了HPLC－NMR技術(shù)的微量、快速的特點。楊春等［18］用高效液相色譜－核磁共振(HPLC－NMR)聯(lián)用技術(shù)中的連續(xù)流動和停止流動兩種模式對萘哌地爾中雜質(zhì)進行檢測，將萘哌地爾樣品用乙腈溶解為濃度5 g/L。高效液相色譜的分析柱采用 Inertsil ODS－3 柱(4.6 I.D.×250 mm，5μm)。連續(xù)流動的進樣量為20μL，停止流動的進樣量為 50μL。檢測器為 Varian Prostar－330二極管陣列檢測器，紫外檢測波長為210 nm。HPLC分離條件為乙腈 ∶磷酸緩沖溶液=65∶35(pH7.8－8.0)。所有的圖譜均在 INOVA－500核磁共振儀上完成。根據(jù)1HNMR，1H－1HCOSY譜完成了主要雜質(zhì)1－萘環(huán)－丙三醇結(jié)構(gòu)鑒定。

LC－NMR的特點不僅是LC的高效分離能力和NMR精確的結(jié)構(gòu)分析能力，更體現(xiàn)在兩者的有機結(jié)合。特別是當(dāng)前超低溫探頭技術(shù)、微探頭技術(shù)、流動抑制技術(shù)使LC－NMR的應(yīng)用在藥物分析中更加深入廣泛。

5 結(jié)語

隨著技術(shù)水平和新型儀器水平的不斷提高，色譜法成為各國藥典中發(fā)展較快的藥物分析方法。在藥物質(zhì)量控制、天然藥物及中成藥分析、生物制品分析、藥物代謝分析、藥物制劑分析等諸多領(lǐng)域里，具有廣泛的應(yīng)用價值。根據(jù)待測樣品的性質(zhì)、檢測要求等可采取不同的色譜法:如薄層色譜法，主要用于有關(guān)物質(zhì)的檢測以保證藥品的純度。氣相色譜因待測物質(zhì)需要氣化，因此適用于易揮發(fā)、對熱穩(wěn)定的樣品。高效液相色譜法對樣品要求較低、選擇性好、靈敏度高，其檢出限低。因此，它是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的藥物分析方法。

目前各學(xué)科間各種技術(shù)的相互滲透，不斷涌現(xiàn)出各種新穎的色譜方法，并朝著微量化、自動化、聯(lián)用化方向發(fā)展，尤其是色譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，更加拓展了色譜法的深度，更加擴大了色譜法的檢測范圍，因而在醫(yī)藥研究領(lǐng)域里，其使用范圍將更加廣泛，也更具有現(xiàn)代科學(xué)意義。

［1］郭磊，吳弼東，謝劍煒藥物分析檢測技術(shù)研究進展［J］.中國科學(xué):生命科學(xué)，2011，41(10):904－912.

［2］曾蘇，程翼宇.藥物分析學(xué)研究進展［J］.浙江大學(xué)學(xué)報，2004，33(1):2－6.

［3］馮雅斌，杜靚，溫靜.薄層色譜法在藥物分析中的應(yīng)用及研究進展［J］.疾病監(jiān)測與控制雜志，2011，5(1):60－63.

［4］呂長淮.薄層色譜法在藥物分析中的應(yīng)用進展［J］.中國藥房，2006，17(22):1748－1749.

［5］宋麗，廖洪利，謝靜等.色譜法檢測藥物雜質(zhì)的研究進展［J］.西南軍醫(yī)，2007，9(5):79－82.

［6］畢雪艷，趙作連，余衛(wèi)兵等.薄層色譜法檢查復(fù)方氨酚烷胺顆粒中的有關(guān)物質(zhì)［J］.中國藥事，2006，20(3):175－176.

［7］張尊聽，劉謙光，何清等.新型薄層色譜內(nèi)標法測定葛根素含量［J］.分析化學(xué)，2002(3):327－330.

［8］李成，張開禮，巫小娟等.氣相色譜法測定復(fù)方達克羅寧薄荷腦潤膚止癢水中薄荷腦含量［J］.藥物鑒定，2011，20(13):16－17.

［9］賀煥華，于沛，黃克難等.氣相色譜法測定頭孢吡肟中N－甲基吡咯烷雜質(zhì)含量［J］.中國抗生素雜志，2007，32(2):87－88.

［10］劉敏，龐發(fā)根，李玉蘭等.氣相色譜法測定撲米酮片中撲米酮的含量［J］.天津藥學(xué)，2008，20(5):17－18.

［11］朱莉萍，朱濤，武娜等.高效液相色譜法測定豬肉中氟喹諾酮類藥物［J］.肉類研究，2008，25(10):29－31.

［12］林祖武.HPLC法測定苦參洗劑中苦參堿的含量［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，17(10):70－71.

［13］趙軍，朱晨，韓玲等.反相高效液相色譜法同時分離和測定多種頭孢菌素［J］.山東大學(xué)學(xué)報，2006，41(4):145－151.

［14］陳琴華，李鵬，彭林等.氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30(3):239－241.

［15］朱全紅，陳飛龍，白霜等.GC－MS法測定尿液中麻黃湯代謝產(chǎn)物麻黃類生物堿的濃度［J］.藥物分析雜志，2005，25(9):1030－1034.

［16］陳吉漢，路勇，姜潔等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉與雞蛋中6種他汀類藥物殘留［J］.分析化學(xué)，2014，42(2):209－214.

［17］王映紅，李娜，賀文義.高效液相色譜－核磁共振聯(lián)用技術(shù)在蛇葡萄根提取混合物中的應(yīng)用研究［J］.波譜學(xué)雜志，2001，18(3):229－234.

［18］楊春，司伊康，賀文義.高效液相色譜－核磁共振儀聯(lián)用技術(shù)在耐哌地爾雜質(zhì)檢測中的應(yīng)用［J］.分析化學(xué)，2001，29(7):796－798.