HPLC法測定哮喘顆粒中苦杏仁苷的含量

茍小軍，黃 強

0 引言

哮喘顆粒系臨床經(jīng)驗方，是由苦杏仁、麻黃、紫蘇子、茯苓、葶藶子、牛蒡子、厚樸、黃芩、柴胡、甘草10味中藥組成的復(fù)方制劑。方中苦杏仁為主藥，具有降氣止咳平喘、潤腸通便的功效?？嘈尤受帐强嘈尤实闹饕钚猿煞?，口服后，在酶的作用下，最終分解生成氫氰酸和苯甲醛。但苦杏仁苷口服較大劑量會出現(xiàn)氰化物中毒[1]，且藥材市場上充斥著苦杏仁假劣藥材的現(xiàn)象，因此，為有效控制哮喘顆粒質(zhì)量，確保該制劑的療效與安全，本試驗以方中主藥苦杏仁的有效成分—苦杏仁苷作為指標(biāo)成分，采用HPLC法直接測定苦杏仁苷的含量，結(jié)果滿意，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent高效液相色譜儀(四元泵，DAD檢測器，自動進(jìn)樣器)，Agilent1200化學(xué)工作站；BP211D型電子分析天平(德國Sartoius)。苦杏仁苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110820-201003)；哮喘顆粒(自制，批號：130312，規(guī)格：15 g/袋)；水為超純水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-1%磷酸水(21∶79)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀中測定。結(jié)果苦杏仁苷在20 min內(nèi)出峰，而且與前后峰均有較好的分離，理論板數(shù)在3 000以上。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取苦杏仁苷8.07 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得[2]。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置于具塞三角燒瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放至室溫，稱重，用甲醇補充減失的重量，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[3]。

2.3.3 陰性對照試驗 按處方取缺苦杏仁的陰性對照藥，按供試品溶液制備方法，制得陰性對照溶液，進(jìn)樣，依法測定，結(jié)果陰性對照液在相同位置處無與苦杏仁苷相對應(yīng)的色譜峰，表明處方中其他藥材和輔料不干擾苦杏仁苷的測定。

2.4 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取對照品溶液3、5、10、15、20 μL進(jìn)樣，以峰面積(Y)對進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸，苦杏仁苷的回歸方程：Y=978.4 X+1.402 4(r=0.999 8)，表明進(jìn)樣量在0.161 4～3.228 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取上述對照品溶液10 μL，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測定苦杏仁苷峰面積值，計算其RSD為0.97%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、8、24 h測定苦杏仁苷峰面積，結(jié)果RSD為1.02%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性實驗 精密稱取同一批次的樣品6份，按照供試品溶液制備方法得到供試品溶液，按上述色譜條件測定苦杏仁苷的含量，其RSD為1.18%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實驗 采用加樣回收法測定，取已知含量的樣品(批號：130308)研細(xì)，取約1 g，精密稱定，精密加入苦杏仁苷對照品適量，制成供試品溶液，依法測定，計算加樣回收率。見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.9 樣品測定 取3批樣品各1 g，精密稱定，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，10 μL進(jìn)樣。結(jié)果批號為130308、130312、130315的樣品的苦杏仁苷含量分別為3.380 6、3.566 9、3.457 5 mg/g,平均為3.47 mg/g。

3 討論

3.1 檢測指標(biāo)的選擇 苦杏仁苷是常見的氰苷類物質(zhì)，也是傳統(tǒng)中藥苦杏仁中的有效成分，迄今已成為醫(yī)藥上常用的祛痰止咳劑、輔助性抗癌藥物[4]。在苦杏仁酶和櫻葉酶的作用下，苦杏仁苷水解生成野櫻皮苷和杏仁氰，后者不穩(wěn)定，容易生成苯甲醛和氫氰酸。氫氰酸有毒性，攝入過量會與細(xì)胞線粒體的細(xì)胞色素氧化酶作用，引起細(xì)胞抑制而導(dǎo)致死亡[5]。為了確保臨床用藥安全有效，用含量測定控制制劑及原料藥的質(zhì)量優(yōu)劣具有重要意義。本試驗以苦杏仁苷為指標(biāo)成分，用HPLC法測定哮喘顆粒中苦杏仁苷的含量。

3.2 流動相的選擇 苦杏仁藥材中苦杏仁苷的法定測定方法是用甲醇提取并稀釋，以乙腈-0.1%磷酸為流動相[6]。為了盡可能避免溶劑峰對試驗的干擾，本試驗中采用的流動相是甲醇-1%磷酸水(21∶79)。筆者曾比較多種流動相，發(fā)現(xiàn)以甲醇-1%磷酸水(21∶79)作為流動相，可使苦杏仁苷峰達(dá)到較好分離，峰形較好，理論板數(shù)高，故選其作為流動相。

3.3 測定波長的確定 本試驗選擇苦杏仁苷對照品甲醇溶液在400～200 nm波長用紫外分光光度計掃描，結(jié)果在268、258 nm波長處有最大吸收，與植物藥有效成分手冊中記載一致，但吸收較弱。王乾蕾等[7]以210、225、215 nm為檢測波長測定苦杏仁苷，參照藥典苦杏仁下的檢測波長，結(jié)果顯示，苦杏仁苷在210 nm下有較好吸收，得到較大的峰面積，故選擇210 nm為檢測波長。

3.4 提取條件的選定 筆者曾考察甲醇、50%甲醇、乙醇等提取溶劑，結(jié)果表明，甲醇提取效果最好；對超聲提取時間(10、15、20、30、40 min)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，隨超聲時間延長，含量增加，但 30 min后含量不再增加，故選擇超聲提取30 min。

參考文獻(xiàn)：

[1] 邢國秀,李楠,楊美艷,等.天然苦杏仁苷的研究進(jìn)展[J].中藥材,2003,25(12):1007-1009.

[2] 蔣玉芳,陳宗良,吳立成.HPLC法測定前列安通膠囊中苦杏仁苷的含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2013,31(1):215-216.

[3] 李翔,劉皈陽,馬建麗,等.HPLC法測定克咳膠囊中苦杏仁苷的含量[J].中國藥師,2013,16(7):1010-1011.

[4] 夏其樂,王濤,陸勝民,等.苦杏仁苷的分析、提取純化及藥理作用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2013,34(21):403-407.

[5] 許寧俠.苦杏仁苷的研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2012,9:66-67.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:187.

[7] 王乾蕾,李運景,余鍵,等.高效液相色譜法測定清肺合劑中苦杏仁苷含量[J].中國藥業(yè),2008,17(19):31-32.