小麥單倍體誘導(dǎo)技術(shù)及其應(yīng)用

董艷輝 ，于宇鳳 ，趙興華 ，王長彪 ，任永康 ，唐朝暉

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；2.太原市外國語學(xué)校，山西太原030027；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030032）

單倍體是指具有配子染色體數(shù)的個體，利用小麥單倍體誘導(dǎo)技術(shù)產(chǎn)生單倍體并加倍獲得全部基因同質(zhì)的純合二倍體純系，是快速培育小麥新品種和構(gòu)建特殊遺傳群體的重要途徑[1]。目前，小麥單倍體獲得途徑主要包括花藥培養(yǎng)、花粉（小孢子）培養(yǎng)、異源種屬花粉誘導(dǎo)（染色體消除）以及輻射和化學(xué)試劑處理等[2]。其中以小麥花藥培養(yǎng)技術(shù)獲得小麥單倍體比較成熟，現(xiàn)已建立了完整的技術(shù)體系，選育了諸如京花1號、京花10號、花培3號、花培5號、花培6號、奎花1號、陜農(nóng)28等一系列優(yōu)良的小麥品種，其在生產(chǎn)上大面積推廣種植，取得了良好的社會經(jīng)濟效益[3]。

本文綜述了目前主要的小麥單倍體誘導(dǎo)技術(shù)在國內(nèi)外的最新研究進展及其在應(yīng)用中存在的問題，旨在為相關(guān)專業(yè)研究人員提供參考，促進小麥單倍體育種技術(shù)的進一步發(fā)展和完善。

1 小麥單倍體誘導(dǎo)技術(shù)

1.1 花藥培養(yǎng)技術(shù)

小麥花藥培養(yǎng)育種是20世紀(jì)70年代開始發(fā)展起來的一種新型育種方法，以其周期短、性狀選擇準(zhǔn)確、創(chuàng)造變異和DH群體快等獨特優(yōu)勢受到小麥育種者的高度重視，其在理論和應(yīng)用研究方面都得到了較大的發(fā)展，已經(jīng)形成一個比較完善的育種技術(shù)體系。但是該技術(shù)還存在基因型依賴、白化苗等問題，限制了小麥花藥培養(yǎng)的綠苗分化率。

小麥花藥培養(yǎng)力高低受自身基因型的顯著影響，不同品種的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率差異比較大。韓曉峰等[4]通過對不同親本組合進行研究，結(jié)果表明，花藥培養(yǎng)力的遺傳為多基因控制的數(shù)量性狀，通過橋梁親本可以改善花藥培養(yǎng)力低但農(nóng)藝性狀優(yōu)良的親本，一定程度上降低了基因型依賴性對小麥花藥培養(yǎng)的影響；徐龍珠等[5]通過對同一組合的正交反交研究表明，母本對花培誘導(dǎo)率的影響大于父本，可能存在著細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)；康明輝等[6]通過長期的實踐指出，在選配親本時除了要考慮花培效率高的橋梁親本，還要兼顧中心親本的優(yōu)良性狀，以提高花藥培養(yǎng)后代優(yōu)良基因型出現(xiàn)的概率。

大量研究表明，小麥花藥培養(yǎng)中會產(chǎn)生大量的白化苗?；ǚ郯谆绲拇罅看嬖诔蔀楹瘫究浦参锘ㄋ幣囵B(yǎng)在育種實踐上應(yīng)用的重要障礙，因此，研究白化苗的成因、尋求控制方法不僅是花藥培養(yǎng)中亟待解決的問題，而且對探討發(fā)育遺傳學(xué)、高等植物的基因調(diào)控等重要理論問題也意義重大。白化苗的產(chǎn)生受基因型、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等因素的影響，通過改善這些因素可在一定程度上減少白化苗的產(chǎn)生，但還未達到理想的效果。葉興國等[7-8]利用RAPD分析了來自同一基因型的綠苗和白化苗，結(jié)果表明，白化苗的發(fā)生屬于遺傳原因，是染色體上DNA結(jié)構(gòu)的改變引起控制葉綠素的基因突變，而不同基因型對培養(yǎng)基的化學(xué)成分敏感度不同，導(dǎo)致不同基因型白化苗率不同；Torp等[9]應(yīng)用RFLP技術(shù)成功檢測到3個與綠苗再生相關(guān)的QTL位點，分別在2AL，2BL，5BL上；海燕等[10]在分化培養(yǎng)基上附加稀土的研究表明，附加1.5 mg/L的稀土能夠顯著提高花粉綠苗分化率，從13.72%提高到27.51%；蔣寧等[11]通過對大量雜交組合花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加植物生長調(diào)節(jié)劑4PU-30的研究表明，適宜濃度的4PU-30能顯著提高愈傷組織分化綠苗的比例，降低白化苗的比例。因此，隨著研究的不斷深入、材料的不斷積累和培養(yǎng)基的不斷調(diào)整，小麥花藥培養(yǎng)技術(shù)正向著更能克服各種限制因素的方向發(fā)展。

1.2 花粉（小孢子）培養(yǎng)技術(shù)

小孢子培養(yǎng)是在花藥培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高效再生技術(shù)體系，屬于單細(xì)胞培養(yǎng)，與屬于器官培養(yǎng)的花藥培養(yǎng)不同。與花藥培養(yǎng)相比，小孢子培養(yǎng)主要是通過胚胎發(fā)生途徑發(fā)育成植株，避免了愈傷組織階段，減少因孢子體變異而引起的農(nóng)藝性狀退化，顯著提高單倍體產(chǎn)生頻率和減少白化苗的產(chǎn)生量[3]。因此，國內(nèi)外都開展了此項研究，并且在甘藍型油菜、馬鈴薯、大麥、水稻、玉米、小麥、亞麻等糧經(jīng)作物以及眾多蕓薹屬蔬菜上獲得成功。

小孢子培養(yǎng)技術(shù)在麥類作物中的大麥上研究比較深入，但直到1993年Tuvesson等[12]才成功地報道小麥的小孢子培養(yǎng)植株。近年來，國際上有關(guān)花粉培養(yǎng)技術(shù)的研究進展很大，已成功建立了小麥小孢子的培養(yǎng)體系，同時在克服基因型限制問題上也有了一定的進展。目前，用于小麥小孢子的分離方法共有4種，即振蕩、漂浮、離析和攪拌。Gustafson等[13]通過測定分離后的小孢子活力對4種分離方法進行比較研究認(rèn)為，振蕩方法是最佳的分離方法，在游離小孢子培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中加入未成熟子房，可以大大改善小孢子的培養(yǎng)反應(yīng)，提高胚胎的發(fā)生頻率。Mejza等[14]研究認(rèn)為，子房對小孢子起到一種看護作用，小孢子胚胎的形成是子房的生物功能，但具體作用機理還不清楚。Scott等[15]在麥芽糖以及麥芽糖結(jié)合不同濃度的葡萄糖、蔗糖和甘露糖的對比試驗中發(fā)現(xiàn)，只含有麥芽糖的培養(yǎng)基能有效地誘導(dǎo)小麥小孢子發(fā)育成胚胎，而在含有其他種類碳源的培養(yǎng)基上，小孢子開始積累淀粉粒，最終死亡，沒能成功地誘導(dǎo)出胚胎。還有研究表明，低溫處理、饑餓加高溫脅迫處理能夠有效提高小孢子胚胎發(fā)生率。但饑餓加高溫脅迫處理是否會對小孢子胚胎自然加倍率產(chǎn)生負(fù)面影響還需要進一步研究。

與花藥培養(yǎng)相似，小麥小孢子培養(yǎng)中也存在白化苗和基因型限制問題。小孢子培養(yǎng)的研究表明，再生苗中白化苗的比率存在明顯的基因型依賴性，有的基因型再生苗中70%為綠苗，而有的基因型中只有少數(shù)幾株綠苗，這還有待于進一步研究。值得高興的是，小孢子培養(yǎng)中基因型限制問題比花藥培養(yǎng)中表現(xiàn)得要輕。Touraev等[16]通過前期的脅迫處理和小孢子的分離純化，在供試的若干基因型中都以較高頻率得到了胚胎，其中包括在花藥培養(yǎng)中反應(yīng)極差的基因型。說明小麥單倍體生產(chǎn)中基因型限制問題有望通過小孢子培養(yǎng)得到克服。

1.3 異源種屬花粉誘導(dǎo)（染色體消除）

Wilson[17]首次進行小麥與黑麥屬間雜交，開拓了小麥遠緣雜交育種的新領(lǐng)域。后來，隨著小麥遠緣雜交工作的不斷進展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，在小麥與大麥、玉米、高粱、珍珠粟、大芻草的雜交中都能有效地誘導(dǎo)小麥單倍體的產(chǎn)生，但是種間雜交導(dǎo)致體細(xì)胞染色體消失的分子基礎(chǔ)尚不清楚。有一種假說認(rèn)為，存在種間差異的親本著絲粒與紡錘體之間發(fā)生互作而導(dǎo)致染色體選擇性消失。

Lein[18]研究發(fā)現(xiàn)，小麥與黑麥的可交配性是由Kr1，Kr2這2個顯性基因控制，并推測Kr基因可能控制著普通小麥與其他種屬雜交的親和性。因而，可交配基因Kr的發(fā)現(xiàn)為小麥遠緣雜交奠定了理論基礎(chǔ)。宋仁敬[19]成功地用球莖大麥法獲得了小麥單倍體，但是，由于許多小麥品種帶有顯性Kr1和Kr2基因，限制了小麥與四倍體球莖大麥雜交產(chǎn)生單倍體的方法在育種上的應(yīng)用。

Zenkteler等[20]首次報道了玉米花粉誘導(dǎo)小麥獲得球形胚?，F(xiàn)有研究表明，玉米對小麥可交配基因Kr不敏感，單倍體的產(chǎn)生對于小麥基因型沒有嚴(yán)格的選擇，開辟了小麥單倍體育種的新途徑。Laurie[21]首次利用小穗培養(yǎng)法獲得小麥與玉米雜交產(chǎn)生的單倍體植株。Niroula等[22]研究了玉米基因型對胚形成和幼苗再生的影響，結(jié)果表明，玉米基因型對單倍體胚形成和小穗再生的差異很大。因此，通過選擇和培育更敏感的玉米基因型可以提高單倍體胚誘導(dǎo)。小麥×玉米誘導(dǎo)單倍體誘導(dǎo)技術(shù)具有單倍體誘導(dǎo)效率高、不產(chǎn)生白化苗和誘導(dǎo)小麥單倍體遺傳穩(wěn)定性高等優(yōu)點，經(jīng)過近年來迅速發(fā)展，該方法已成為目前國內(nèi)外產(chǎn)生小麥單倍體的重要途徑。

最新研究表明[23-24]，通過對著絲粒特異性組蛋白基因CENH3進行改造得到突變體，然后雜交得到雜合型合子，由于雙方親本的著絲?；プ鳎沟脕碜酝蛔凅w的染色體組在合子的有絲分裂中丟失，經(jīng)發(fā)育得到只含有非突變體親本一套染色體的植株，單倍體誘導(dǎo)率達50%。這一技術(shù)已在擬南芥試驗中取得成功，由于CENH3普遍存在于真核生物中，且擬南芥細(xì)胞中著絲粒的DNA結(jié)構(gòu)與大部分植物細(xì)胞內(nèi)的著絲粒DNA結(jié)構(gòu)有很大的相似性，因此，相信這一方法也可用于小麥單倍體育種中。

1.4 輻射和化學(xué)誘導(dǎo)

利用X，γ，32P，60Co等射線和紫外線照射花粉，然后給去雄的母本授粉，刺激卵細(xì)胞分裂并發(fā)育成單倍體的胚胎，從而得到母系單倍體植株。這一項技術(shù)已經(jīng)在很多植物中取得成功。

化學(xué)藥劑誘導(dǎo)小麥孤雌生殖在育種實踐上有一定的目的性和預(yù)見性，操作相對簡便，成本也較低。但存在因誘導(dǎo)效果差而造成優(yōu)良基因型丟失的缺點。目前，主要誘導(dǎo)藥劑有：DMSO，BA，KT，2，4-D，NAA，GA3，TRTA，DMSO＋對氯苯氧乙酸，DMSO＋KT，DMSO＋GA3，DMSO＋NAA，DMSO＋KT＋鄰氯苯氧乙酸和甲苯胺藍等。

該方法適合小麥花藥培養(yǎng)、花粉（小孢子）培養(yǎng)不易成功的基因型，選擇合適的輻射劑量或藥劑濃度是該方法成功的關(guān)鍵，也是本研究的難點。

2 小麥單倍體加倍

小麥單倍體誘導(dǎo)技術(shù)已經(jīng)被廣大小麥育種者廣泛應(yīng)用，但是單倍體植株的加倍問題依舊是育種者需要進一步探討和解決的問題，目前主要的方法有自然加倍和人工加倍。

花藥、花粉（小孢子）培養(yǎng)得到的單倍體植株都具有自然加倍的現(xiàn)象，但因基因型等的不同自然加倍率也有所不同。花藥培養(yǎng)植株自然加倍率一般在20%～30%之間[25]；小麥的小孢子培養(yǎng)中，有20%～78%的再生綠色植株是加倍的，具體的加倍機理還不清楚。但是通過一些處理方法也能夠提高自然加倍率，比如冷處理、饑餓處理和高溫脅迫等，冷處理能夠提高自然加倍率已經(jīng)在花藥培養(yǎng)和小孢子培養(yǎng)中得到證實。異源種屬花粉誘導(dǎo)獲得的小麥單倍體染色體自然加倍現(xiàn)象較少，特別是小麥×玉米產(chǎn)生的植株基本上是單倍體。

由于自然加倍率低，且部分單倍體無自然加倍現(xiàn)象，因此，對于小麥單倍體植株加倍，許多小麥育種者進行了多方面的試驗研究，提出過多種加倍方法，其中秋水仙堿法應(yīng)用比較廣泛。目前，報道較多的是用高濃度的秋水仙堿處理幼苗根部，但是高濃度的秋水仙堿對植株的毒害作用比較大，加倍處理后較難成活，降低了加倍率；同時由于秋水仙堿作用停止后，會產(chǎn)生部分非二倍體植株。有報道用一定濃度的秋水仙堿和DMSO結(jié)合處理單倍體植株，加倍效率顯著提高；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海燕等[25]設(shè)計的小麥半浸根染色體加倍技術(shù)，加倍后成活株率達98.1%；成活株加倍結(jié)實株率穩(wěn)定在80%，在花藥培養(yǎng)獲得的幼苗中取得了良好的應(yīng)用效果。

目前，通過秋水仙堿等化學(xué)藥品的處理，不需要任何特定的基因型很容易能獲得小麥加倍單倍體，但染色體自然加倍所形成的加倍單倍體和人工加倍獲得的加倍單倍體不同，前者除整雙二倍體外常還有非整倍體，利用這些非整倍體可培育添加系、替換系等，還可用來進行基因定位，在引入外源基因的雜交育種中，這些非整倍體的應(yīng)用要比整倍體更為廣泛。所以，很多組培工作者仍然采用單倍體植株的自然加倍方法：為了進一步利用自然加倍不成功的單倍體植株，以保住特定情況下的優(yōu)良材料，研究人員采用單倍體植株幼穗或者葉片進行離體培養(yǎng)，使其再次自然加倍，并且已經(jīng)取得了成功。

3 展望

從小麥雜交育種到現(xiàn)在可以預(yù)見性地通過多種途徑獲得優(yōu)良小麥材料，這不得不說是小麥單倍體誘導(dǎo)技術(shù)的巨大貢獻。目前，其已在小麥基礎(chǔ)研究和育種方面發(fā)揮了重要的作用，但是這些技術(shù)的應(yīng)用僅僅局限于在相對較短的時間內(nèi)得到基因型純合的小麥植株和實現(xiàn)雜種優(yōu)勢育種方面，有關(guān)小麥自然加倍和人工加倍倍性效應(yīng)表達調(diào)控機理以及遺傳行為的研究只是局限在基因組的某個特異位點，還不能極大地滿足小麥育種的需求?？梢灶A(yù)見，隨著染色體工程的建立與應(yīng)用，RNAi等一系列先進技術(shù)的涌現(xiàn)，自然加倍與人工加倍植株的加倍機理和遺傳行為進一步明確，將為小麥單倍體育種研究提供更為廣闊的思路與方法。

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