勞氏紫瑞利共振散射熒光法測(cè)定肝素鈉

李志云，劉保生

(河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

肝素鈉系自豬的腸黏膜或牛肺中提取精制的一種硫酸氨基葡聚糖鈉鹽，屬黏多糖類(lèi)物質(zhì). 本品具有帶強(qiáng)負(fù)電荷的理化特性，能干擾血凝過(guò)程的許多環(huán)節(jié)，在體內(nèi)外都有抗凝血作用，主要用于防治血栓形成或栓塞性疾病(如心肌梗死、血栓性靜脈炎、肺栓塞等)及各種原因引起的彌漫性血管內(nèi)凝血，也用于血液透析、體外循環(huán)、導(dǎo)管術(shù)、微血管手術(shù)等操作及某些血液標(biāo)本或器械的抗凝處理.

測(cè)定肝素鈉的方法有光度法[1]，CdTe 量子點(diǎn)作探針共振瑞利散射色譜法[2]，修飾電極法[3]，高效液相色譜法[4]，電泳法[5]，電化學(xué)傳感器[6]，生物法[7]和利用稀土測(cè)試肝素鈉也有報(bào)道[8-10].本文在近中性的BR緩沖溶液中，由于勞氏紫與肝素鈉反應(yīng)形成離子締合物，使得共振散射強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，據(jù)此對(duì)肝素鈉注射液進(jìn)行含量測(cè)定，方法準(zhǔn)確、快速，對(duì)肝素鈉的快速測(cè)定有一定的意義.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

RF-5301熒光光度計(jì)(日本島津)；pHS-3型酸度計(jì)(上海虹益儀器儀表有限公司).

肝素鈉(Heparin Sodium)對(duì)照品：準(zhǔn)確稱(chēng)取肝素鈉 0.1000 g用水定溶于100 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為1.0 g/L的溶液，放入冰箱中保存，用時(shí)稀釋10倍.

5.0×10-4mol/L的勞氏紫水溶液；pH =6.5的BR緩沖溶液(Britton-Robinson,H3PO4-HAc-H3BO3).實(shí)驗(yàn)所用試劑皆為分析純，水為蒸餾水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

于10 mL比色管中，加入pH =6.5 BR緩沖溶液0.75 mL、5.0×10-4mol/L的勞氏紫溶液1.0 mL，一定量肝素鈉溶液，以水定容，搖勻，靜置15 min. 以Δλ=0(λem=λex)進(jìn)行同步掃描，記錄564 nm處體系的ΔI=I-I0值(體系散射光強(qiáng)度I、空白溶液I0).

2 結(jié)果與討論

2.1 體系的共振譜圖

按實(shí)驗(yàn)方法操作，結(jié)果見(jiàn)圖1. 由圖1可知，單獨(dú)的肝素鈉在測(cè)定條件下的RRS光譜較弱，勞氏紫在測(cè)定條件下無(wú)RRS信號(hào). 在pH =6.5緩沖溶液中，勞氏紫為陽(yáng)離子，肝素鈉為陰離子，兩者能通過(guò)靜電引力結(jié)合. 因此，肝素鈉與勞氏紫染料共存時(shí)，兩者反應(yīng)，造成體系瑞利共振散射信號(hào)增強(qiáng)，產(chǎn)生新的瑞利共振散射光譜，其最大峰出現(xiàn)在564 nm.

1-4.肝素鈉的質(zhì)量濃度分別為0， 0.40， 0.44， 0.47 mg/L圖1 肝素鈉與勞氏紫的共振光譜Fig.1 Resonance spectra of thionine with various concentrations of heparin sodium

2.2 酸度的影響

改變?nèi)芤核岫?，按?shí)驗(yàn)方法操作，考察pH值對(duì)體系RRS的影響，見(jiàn)圖2. 由圖2可以看出，pH在5.0～9.0時(shí)體系的RRS較大且穩(wěn)定，據(jù)此選pH =6.5作為實(shí)驗(yàn)最佳酸度條件.

圖2 酸度對(duì)勞氏紫-肝素鈉體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of acidity on fluorescence intensity of thionine-heparin sodium system

2.3 緩沖溶液用量

選用pH =6.5的BR緩沖溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明用量在0.5 ～ 1.2 mL時(shí)勞氏紫-肝素鈉體系的RRS最大且基本穩(wěn)定，因此選0.75 mL為其最佳用量.

2.4 穩(wěn)定性

按實(shí)驗(yàn)方法配制溶液，對(duì)體系的穩(wěn)定性進(jìn)行了連續(xù)測(cè)定，每次測(cè)定間隔3 min.結(jié)果表明，體系RRS在30 min內(nèi)保持不變，據(jù)此選擇靜置時(shí)間15 min.

2.5 工作曲線

改變肝素鈉溶液用量繪制工作曲線，其線性回歸方程為:ΔI=0.125+16.88ρ(mg/L)，相關(guān)系數(shù)r=0.998 4，肝素鈉的線性范圍為0.025 ～ 0.500 mg/L.測(cè)定最佳條件下11份空白溶液的RRS強(qiáng)度，按3 σ/K法計(jì)算得方法檢出限為9.16 μg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是3.17%.

2.6 樣品及回收率的測(cè)定

取不同廠家或批號(hào)的肝素鈉注射液(標(biāo)示量12 500單位/ 2 mL)進(jìn)行含量測(cè)定，用移液管取0.1 mL于200 mL容量瓶中稀釋?zhuān)僖迫≡撊芤?.1 mL按實(shí)驗(yàn)方法操作，平行6次測(cè)定其RRS強(qiáng)度值，以6次平均值作為測(cè)定結(jié)果并計(jì)算方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，同時(shí)加入0.2 mg/L肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1. 從表1可以看出，樣品平行6次測(cè)定，方法回收率為104.0%～106.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.67%～3.01%，均在允許范圍內(nèi)，表明結(jié)果令人滿意，方法可行. 按140單位效價(jià)/mg折算注射液的肝素鈉效價(jià)，其效價(jià)為108%～114%，符合藥典規(guī)定效價(jià)應(yīng)為標(biāo)示量的86%～116%標(biāo)準(zhǔn).

表1 樣品測(cè)定結(jié)果(n =6)

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