乳粉中維生素K1測定的檢驗(yàn)方法研究

文/ 徐亞麥 趙澤民

（黑龍江龍丹乳業(yè)科技股份有限公司）

維生素是一類低分子化合物，它不是構(gòu)成組織的成分，也不供應(yīng)熱能，但它與人體的健康有著密切的關(guān)系。如人體缺乏維生素，不僅不能正常生長發(fā)育，生理作用不能協(xié)調(diào)一致，而且還會(huì)引起各種疾病，甚至死亡。

維生素K類物質(zhì)，簡單地說就是一系列具有維生素K活性的甲萘醌的系列衍生物的總稱。維生素K最早由丹麥化學(xué)家達(dá)姆發(fā)現(xiàn)，達(dá)姆在研究膽固醇代謝原理時(shí)意外發(fā)現(xiàn)與血液凝固有關(guān)的物質(zhì)并證實(shí)其為脂溶性維生素，于是將這種抗出血作用的物質(zhì)命名為維生素K。1939年，人們從綠色植物中提取出了維生素K1，并將其用于治療凝血酶原過低癥及其各種出血癥，收到了很好的效果。

乳品企業(yè)一般采用GB 5413.10－2010測定產(chǎn)品中的維生素K1含量。該方法采用高壓液相色譜法，具有精密度高，分離效果好，分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，為乳制品的質(zhì)量控制和安全監(jiān)測提供了重要的技術(shù)支持。但由于K1性質(zhì)不穩(wěn)定，受光、氧化劑、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿等作用而分解，同時(shí)該方法操作步驟繁瑣、環(huán)節(jié)多，因此很多實(shí)驗(yàn)室在K1的測定過程中出現(xiàn)了不出峰、檢測數(shù)值低、重現(xiàn)性不好等問題。本文特針對這些問題進(jìn)行了試驗(yàn)，最終找到了解決措施，得到了理想的檢測數(shù)據(jù)。

1 測定原理

用脂肪酶降解試樣中的不飽和脂肪酸，對于含淀粉的試樣需要先用淀粉酶降解，經(jīng)堿皂化后，用正己烷提取維生素K1。通過液相色譜法分離，柱后還原維生素K1，熒光檢測器檢測，外標(biāo)法定量。

2 試驗(yàn)方法

2.1 儀器

高壓液相色譜儀（島津L C-20A，帶有熒光檢測器）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海滬西）；控溫空氣浴振蕩器（哈爾濱東聯(lián)）；氮吹儀（天津奧特賽恩斯）；色譜柱（島津，C18，150 mm×4.6 mm，5μm）；鋅還原柱（上海安譜，4.6 mm×50 mm）。

2.2 試劑

脂肪酶（酶活力≥700 U/mg，sigma公司）；維生素K1標(biāo)準(zhǔn)品；甲醇（色譜純）；二氯甲烷（色譜純）；正己烷（色譜純）；冰醋酸（純度99.9%，分析純）；氯化鋅（分析純）；無水乙酸鈉（分析純）等。

2.3 樣品處理

試驗(yàn)過程中要特別注意：由于維生素K1遇光易分解，整個(gè)操作應(yīng)避光。

2.3.1 稱樣約2.5 g于三角瓶中，用30 mL約50 ℃的水溶解。加入1 g脂肪酶，于（37±5）℃控溫空氣浴振蕩器中過夜，使其充分酶解。取出酶解好的試樣，加入2 mL氫氧化鈉溶液，用50 mL乙醇將溶液轉(zhuǎn)入250 mL的分液漏斗中，充分混勻。之后用50 mL正己烷再次潤洗三角瓶，轉(zhuǎn)入分液漏斗中。

2.3.2 先手動(dòng)振搖，放氣，待無氣體排出后放置在搖床上充分振搖2 min，取出靜置分層（若不分層，可加少量飽和氯化鈉溶液）。放出下層水相于另一個(gè)250 mL的分液漏斗中，留下有機(jī)相。

2.3.3 向水相中再次加入50 mL正己烷再次萃取。合并有機(jī)相。用適量蒸餾水洗有機(jī)相2 次。將有機(jī)相通過無水硫酸鈉脫水過濾到一個(gè)500 mL的燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上于（40±2）℃下蒸發(fā)至近干。用正己烷轉(zhuǎn)移殘留物到一個(gè)10 mL的試管中，置氮吹儀上于（40±2）℃下吹干，準(zhǔn)確加入1 mL正己烷，充分振蕩溶解殘留物。將試管放入冰箱中在0 ℃以下冷凍1 h，使沉淀物充分沉淀到試管底部。將上清液經(jīng)微孔濾膜過濾，待測。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜分離條件的選擇

國標(biāo)方法中對于柱溫沒有特別說明，不設(shè)定柱溫會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間漂移，因此本實(shí)驗(yàn)室將柱溫設(shè)定為30 ℃。

配制流動(dòng)相的量筒、燒杯、玻璃棒、溶劑過濾器一定要刷洗干凈，烘干后使用。

3.2 方法線性試驗(yàn)

按色譜條件對維生素K1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，測得回歸方程為：y=1.77×10-7X-0.19，相關(guān)系數(shù)為0.9993。結(jié)果表明，維生素K1在0～4.00 μg/mL線性關(guān)系良好。

3.3 試驗(yàn)過程中要控制好的關(guān)鍵點(diǎn)

3.3.1 脂肪酶（酶解脂肪）：要保證脂肪酶的活力；脂肪酶的加入量不可低于0.6 g，否則酶解不充分，加入正己烷萃取時(shí)萃取不充分，最終導(dǎo)致數(shù)值偏低或檢測不出來；脂肪酶可以直接加入到樣品中，也可以將其溶解后再加入到試樣溶液中，以確保酶更好地溶解；酶解時(shí)間不得少于3 h。

3.3.2 萃取時(shí)，實(shí)驗(yàn)室的溫度最好控制在25 ℃以上，因?yàn)闇囟冗^低會(huì)影響維生素K1的萃取。萃取過程中使用的蒸餾水應(yīng)適當(dāng)加溫，溫度應(yīng)控制在30 ℃左右，保證萃取充分。

3.3.3 氫氧化鈉的作用是使酶解后的脂肪生成脂肪酸鈉溶解于水相中，氫氧化鈉要現(xiàn)用現(xiàn)配，加入的量也不應(yīng)該過多或過少，加入得過少會(huì)不容易分層，加入得過多會(huì)和維生素K1反應(yīng)，都會(huì)使最后的結(jié)果偏低；氫氧化鈉加入后，要給予一定的反應(yīng)時(shí)間，約0.5 min后再加入乙醇，乙醇的作用是可以保護(hù)維生素K1不參與反應(yīng)，促進(jìn)分解，還可以起到消泡作用促進(jìn)分層。

3.3.4 萃取過程振蕩要充分，注意放氣，防止爆炸；收集有機(jī)相的過程要注意避免損失；萃取后要將下層的水相放干凈，否則加水后會(huì)有絮狀沉淀，影響分離效果。

3.3.5 加入飽和氯化鈉的目的是為了防止乳化，更好地分層提取。

3.3.6 有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉脫水時(shí)，要注意分液漏斗內(nèi)的有機(jī)相過濾完后要用正己烷沖洗分液漏斗內(nèi)壁和下方的管口，防止試樣流失。

3.3.7 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)不可蒸干，近干即可。用正己烷少量多次（多于3 次）沖洗到10 mL帶塞的試管中（試管使用之前要用正己烷試漏，避免樣品損失）。

3.3.8 氮吹時(shí)一定要吹干，不吹干定容時(shí)會(huì)使試樣體積不同，影響結(jié)果。

3.3.9 氮吹后加入正己烷充分溶解后，要將試管放入0 ℃以下冰箱中冷凍至少1 h，冷凍的作用是使溶解到有機(jī)相中的少量不飽和脂肪酸凝固下沉。

4 結(jié)語

綜上所述，在維生素K1的測定過程中，要充分了解實(shí)驗(yàn)機(jī)理，掌握操作中的關(guān)鍵點(diǎn)，養(yǎng)成良好的日常操作習(xí)慣；要做到事事仔細(xì)認(rèn)真，不斷總結(jié)得失，善于分析數(shù)據(jù)，方能獲得理想的檢測結(jié)果。

[1]顧瑞霞.乳與乳制品的生理功能特性.北京：中國輕工業(yè)出版社，2000.

[2]丁靜煦.維生素K的應(yīng)用和生產(chǎn)介紹.中國維生素發(fā)展研討會(huì)論文集，2005-11-24.

[3]王昂，王麗麗，蔣沁，等.維生素K的生產(chǎn)及應(yīng)用研究.河北化工雜志，2008（9）：35-37.

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5413.10－2010 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素K1的測定.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.