阿爾茨海默病生物標(biāo)記物的研究現(xiàn)狀Δ

劉芷，劉愛敬，李曉龍，李歡，畢開順，賈英#（.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院沈陽市中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)篩選與評價重點實驗室，沈陽 006；.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院中藥質(zhì)量控制關(guān)鍵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，沈陽 006）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD），又稱老年性癡呆，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，為老年群體常見病。目前，AD的發(fā)病機制尚未完全明確，但是可以確定AD是一種在發(fā)病過程中受多個發(fā)病機制和病理學(xué)影響的慢性神經(jīng)退行性疾病。AD的特征性神經(jīng)病理標(biāo)志是細(xì)胞外β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積，細(xì)胞內(nèi)由磷酸化的Tau蛋白（含量最高的微管相關(guān)蛋白，AD患者腦Tau蛋白異常過度磷酸化）形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)，突觸、樹突和神經(jīng)元減少。進(jìn)一步來說，分子機制包括免疫學(xué)改變、炎癥、氧化應(yīng)激、微血管變化和興奮性中毒等[1]。目前對用于AD診斷和治療評價的生物標(biāo)記物的研究已成為熱點。

真正的AD生物標(biāo)記物必須能反映AD相關(guān)的分子機制和神經(jīng)病理學(xué)的發(fā)展，包括Aβ生成和聚合，Tau蛋白的高度磷酸化、聚集和神經(jīng)纖維纏結(jié)，從而導(dǎo)致神經(jīng)退化、腦組織丟失和認(rèn)知障礙等[1]。下面就AD發(fā)病機制方面對其生物標(biāo)記物的研究現(xiàn)狀略作總結(jié)和展望。

1 基于β淀粉樣蛋白級聯(lián)學(xué)說的生物標(biāo)記物

β淀粉樣蛋白級聯(lián)學(xué)說支持與AD相關(guān)的基因如淀粉樣前體蛋白（APP）、早老素基因1（PS1）和早老素基因2（PS2）、載脂蛋白E4（ApoEε4）等位基因發(fā)生突變導(dǎo)致Aβ形成和消除發(fā)生異常，Aβ在腦內(nèi)聚集，造成突觸抑制，抑制中間神經(jīng)元的損傷和異常的谷氨酸受體興奮，結(jié)果導(dǎo)致其興奮性中毒，進(jìn)而表現(xiàn)為老年癡呆[2]。

1.1 突變基因標(biāo)記物

基因?qū)W因素也同樣被證實為是一種導(dǎo)致AD形成的病理機制，在常染色體顯性遺傳的家族性早老性的AD中發(fā)現(xiàn)有3個基因（APP、PS1和PS2）發(fā)生突變，但是由此引起的AD在總體病例中只占了極少的比例，還不到1%[3]。常見的遲發(fā)性AD與ApoEε4等位基因或該蛋白編碼的基因有關(guān)，占了AD病例中的大部分[2]。

1.1.1 早發(fā)性AD的基因標(biāo)記物：APP、PS1和PS2[2]。APP基因突變導(dǎo)致Aβ過表達(dá)，引起Aβ在腦內(nèi)聚集，Aβ沉積形成老年斑，造成突觸抑制，興奮性中毒，表現(xiàn)為記憶丟失和認(rèn)知功能障礙，即早發(fā)性AD。大量研究表明[4]，血小板APP異構(gòu)體在AD的發(fā)病過程中起重要作用。Zainaghi IA等[5]通過免疫印跡方法（Western blotting）來測定分析AD患者、輕度認(rèn)知功能障礙（Mild cognitive impairment，MCI）患者和正常老年對照組外周循環(huán)血中血小板APP130-和110-片段的含量比值（APP異構(gòu)體比值），發(fā)現(xiàn)與MCI和正常對照組相比，AD患者中此比值顯著降低，而MCI與正常對照組之間卻并無顯著差異，由此提示APP作為候選標(biāo)記物的可能性。但由于技術(shù)上的局限性及不易于大樣本檢測，與血漿中Aβ水平研究相比，該研究較少受人關(guān)注。

實際上APP突變導(dǎo)致的AD只占早發(fā)性AD的2%左右，早發(fā)性AD主要是由PS1和PS2突變引起的。早老素基因突變攜帶者早在Aβ斑塊沉積前20年功能性和結(jié)構(gòu)性磁共振成像（MRI）均有變化，目前用于早期診斷AD。

1.1.2 晚發(fā)性AD的基因標(biāo)記物：ApoE、A2 M基因。ApoE和來源于淀粉樣前體蛋白的小多肽Aβ的親和力很高。有調(diào)查[6]顯示AD患者中攜帶ε4等位基因者占46.2%，而對照組占13.2%。還發(fā)現(xiàn)攜帶兩個ε4等位基因的研究對象比攜帶一個ε4的研究對象發(fā)生AD年齡早，比不攜帶ε4等位基因的研究對象發(fā)生AD年齡更早?；蚪M研究鑒定得出ApoEε4是伴隨極高發(fā)生率的最遲發(fā)AD基因，明顯的是，具有ApoEε4等位基因兩個復(fù)制品的個體終生就有形成AD的風(fēng)險[2]。

A2 M基因（一種蛋白酶抑制劑巨球蛋白，抑制多種蛋白酶活性）編碼的α2-巨球蛋白是一種急性期反應(yīng)蛋白，沉積于老年斑中，參與和介導(dǎo)Aβ的降解和清除。Colacicco AM等[7]的研究表明A2 M基因突變可導(dǎo)致α2-巨球蛋白喪失與蛋白酶結(jié)合能力，引起Aβ在腦內(nèi)沉積而產(chǎn)生毒性作用，增加AD的患病風(fēng)險。

1.2 Aβ相關(guān)標(biāo)記物

Aβ是形成老年斑SPs的主要成分，也是導(dǎo)致AD的首要原因。Aβ主要有Aβ42和Aβ40兩種形式。Aβ首先在腦內(nèi)沉積，研究證實AD患者腦內(nèi)的Aβ水平比正常組高很多；Aβ還存在于腦脊液和血液中，是目前比較公認(rèn)的AD生物標(biāo)記物。

1.2.1 腦脊液中的Aβ。AD患者的腦脊液中Aβ42水平比正常人降低50；與Aβ42相比，AD患者腦脊液中Aβ40的含量不變或略有增加，因此單純用Aβ42或Aβ40含量來鑒別檢查AD都不是很準(zhǔn)確[6]。有研究[8]證實AD患者腦脊液中Aβ42/Aβ40比例降低，且比Aβ42水平降低更顯著，可以很好地鑒別AD和非AD型癡呆，彌補了Aβ42單獨用于預(yù)測和診斷AD特異性低的不足。

1.2.2 血漿中的Aβ。血漿Aβ來自于外周組織，不能反映腦內(nèi)Aβ代謝，但是腦脊液和血液之間Aβ是可以雙向運輸而達(dá)到動態(tài)平衡，因此血漿中Aβ水平也能在一定程度上幫助鑒別和檢查AD[6]。

1.2.3 Aβ抗體。研究發(fā)現(xiàn)正常人血漿中存在活性多樣的抗Aβ IgG、IgM，這些抗體或抗原抗體復(fù)合物與Aβ的動態(tài)平衡有利于維系A(chǔ)PP代謝的穩(wěn)態(tài)。AD患者可能存在清除Aβ的免疫缺陷，從而加速AD的病理生理進(jìn)程。有研究者采用抗原-抗體解離技術(shù)發(fā)現(xiàn)AD患者血清中天然抗Aβ抗體的濃度顯著高于正常人[9-10]，還發(fā)現(xiàn)AD患者血清內(nèi)解離前后抗Aβ抗體的改變量（即解離量）可直接反映AD的病程，即AD病程越早解離量越大[10]，也就更容易檢測到。因此血漿中的抗Aβ抗體可能成為一個潛在的生物標(biāo)記物。

2 基于神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)的生物標(biāo)記物

在AD患者的腦部發(fā)現(xiàn)一些經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)的失調(diào)[11]，與AD關(guān)系較為肯定的有乙酰膽堿（ACh）、單胺類、氨基酸類（主要是谷氨酸）及神經(jīng)肽類，且這些遞質(zhì)對學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能有特殊作用[12-13]。因此通過評價這些神經(jīng)遞質(zhì)的變化在一定程度上可以預(yù)防AD。

2.1 膽堿能遞質(zhì)：乙酰膽堿（ACh）

ACh是一種神經(jīng)遞質(zhì)，是腦組織中重要的化學(xué)物質(zhì)，AD患者腦內(nèi)ACh含量降低，從而引起記憶丟失和認(rèn)知障礙，是目前較公認(rèn)的發(fā)病機制。目前市面上大部分治療AD的藥物也是基于這一機制，多為膽堿酯酶抑制劑，如西藥鹽酸多奈哌齊和中藥石杉堿甲等。

AD患者腦組織中ACh含量與乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）活性呈顯著正相關(guān)，提示腦組織中ACh含量的降低可能是由于可溶性Aβ導(dǎo)致其合成酶ChAT活性降低所致。研究表明，AD患者的新皮質(zhì)和海馬區(qū)域ACh含量減少，ChAT活性也明顯降低，基底前腦投射到海馬和新皮質(zhì)的膽堿能神經(jīng)元數(shù)目顯著減少，并與認(rèn)知功能障礙程度密切相關(guān)[14]。提示早期AD降低腦組織中可溶性Aβ以及減少其對中樞膽堿能系統(tǒng)的損害可能有助于防治AD的發(fā)生和發(fā)展[15]。

2.2 單胺類遞質(zhì)

中樞單胺類神經(jīng)系統(tǒng)是最重要的中樞遞質(zhì)系統(tǒng)，其神經(jīng)遞質(zhì)包括去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）和5-羥色胺（5-HT）[16]，且具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，對睡眠、感覺、情緒、認(rèn)知等有廣泛的影響。隨著年齡的增加，中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量發(fā)生明顯變化，DA、NE、5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)的活性和轉(zhuǎn)換率有不同程度的降低，從而出現(xiàn)學(xué)習(xí)、情緒和高級認(rèn)知功能等障礙。測量腦或腦脊液內(nèi)單胺類遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量是反映腦內(nèi)單胺類代謝的重要指標(biāo)[11]。有研究表明，與正常人相比，AD患者腦內(nèi)5-HT和DA含量均顯著降低[16]。然而一些抑郁、焦慮和帕金森患者腦脊液和血漿中這些單胺類遞質(zhì)含量也顯著降低[17-18]，因此單純地以單胺類遞質(zhì)的含量來預(yù)測AD具有一定的局限性和盲目性，而將其開發(fā)為AD生物標(biāo)記物還有待進(jìn)一步研究。

2.3 谷氨酸能相關(guān)生物標(biāo)記物：D-[3H]門冬氨酸

很早就有學(xué)者提出AD神經(jīng)元損傷機制的谷氨酸能神經(jīng)元學(xué)說[19]，即過量的谷氨酸對其受體的過度激活，可使神經(jīng)毒性作用產(chǎn)生，導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡，從而出現(xiàn)相應(yīng)的學(xué)習(xí)記憶障礙[20]。有研究顯示AD患者腦內(nèi)谷氨酞胺酶活性及谷氨酸濃度顯著下降，腦中D-[3 H]門冬氨酸的結(jié)合和攝取也有減少[21]。D-[3 H]門冬氨酸通常被認(rèn)為是谷氨酸能神經(jīng)末梢的良好標(biāo)記物，有望被開發(fā)為AD的生物標(biāo)記物。

2.4 神經(jīng)肽類生物標(biāo)記物

神經(jīng)肽是泛指存在于神經(jīng)組織并參與神經(jīng)系統(tǒng)功能作用的內(nèi)源性活性物質(zhì)，是一類特殊的信息物質(zhì)，在體內(nèi)調(diào)節(jié)多種多樣的生理功能，如痛覺、情緒、學(xué)習(xí)與記憶等[22]。有研究發(fā)現(xiàn)在AD患者腦內(nèi)血漿生長抑素（Somatostatin，SS）、精氨酸加壓素（Arginine vasopressin，AVP）、促腎上腺皮質(zhì)激素（Corticotropin，ACTH）、B啡肽（B-endorphin，B-EP）及神經(jīng)肽Y等神經(jīng)肽含量均有所減少。其中AVP和SS含量減少較為明顯，且癡呆程度越重，含量越低[22-24]。因此，AVP和SS可作為AD患者早期的生化指標(biāo)對AD進(jìn)行早期診斷和干預(yù)[25-26]。

3 基于Tau蛋白學(xué)說的生物標(biāo)記物：Tau蛋白

Tau蛋白是微管相關(guān)蛋白，是形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）的主要成分。AD患者腦內(nèi)Tau蛋白高度磷酸化，易于聚集形成NFTs導(dǎo)致神經(jīng)元微管破壞，導(dǎo)致胞體軸突營養(yǎng)物質(zhì)運輸及傳遞障礙，神經(jīng)元退化死亡。AD患者腦脊液中總Tau（T-Tau）和磷酸化的Tau（P-Tau）蛋白水平均顯著升高。

雖然腦積液中Tau蛋白水平增加并不是AD疾病所特有的現(xiàn)象，但是該癥狀也反映了Tau蛋白的病理變化和神經(jīng)元損傷，與臨床疾病輕重程度有關(guān)[27]。

AD患者中T-Tau和P-Tau含量均增加，NFTs也增加。NFTs數(shù)量可以作為臨床檢測AD的一個重要指標(biāo)，因此P-Tau蛋白也就有可能成為AD的生物標(biāo)記物[4]。Tau蛋白至少存在30個磷酸化位點，正常成熟腦中Tau蛋白分子含2～3個磷酸基，目前檢測到的磷酸化位點主要是蘇氨酸181（P-Tau181）、蘇氨酸231（P-Tau231）和絲氨酸199（P-Tau199）。研究發(fā)現(xiàn)其中P-Tau199在診斷AD方面敏感性和特異性可達(dá)85%，P-Tau181的敏感性也很強，可達(dá)83%。Aβ42/P-Tau181比值和T-Tau聯(lián)合使用在鑒別AD方面大大提高了其特異性和敏感性，可作為AD生物標(biāo)記物[28]。

4 炎癥、氧化應(yīng)激等分子機制的生物標(biāo)記物

目前有報道認(rèn)為炎癥、免疫功能異常、自由基和氧化應(yīng)激作用、胰島素相關(guān)糖代謝異常、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、脂質(zhì)代謝異常等因素也與AD的發(fā)生有關(guān)，與此同時，諸多相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物也相繼被發(fā)現(xiàn)。

4.1 炎癥相關(guān)的生物標(biāo)記物

已有研究表明炎癥反應(yīng)參與AD發(fā)病，炎癥激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）以及一些急性時相反應(yīng)蛋白如C反應(yīng)蛋白（CRP）、α1抗糜蛋白酶（ACT）等。有試驗表明AD患者血清IL-1、IL-3、IL-11和CRP水平顯著升高，且隨著病情加重而增加，可以用于診斷AD，判斷AD病情和藥物療效[29]。

4.1.1 CRP。CRP被認(rèn)為是第一個急性時相反應(yīng)蛋白，其直接參與炎癥反應(yīng)。Schmidt R等[30]對一組人群（1050例）進(jìn)行25年的隨訪，發(fā)現(xiàn)AD患者血清中非特異性CRP量比正常高出3倍，故認(rèn)為可溶性CRP也可作為診斷癡呆的生物指標(biāo)，且有臨床癥狀出現(xiàn)前就已長期存在。

4.1.2 AD相關(guān)神經(jīng)絲蛋白（AD7 c-NTP）。AD7 c-NTP存在于神經(jīng)細(xì)胞發(fā)出的軸突中，并且大量存在于AD患者腦中的NFTs中。AD7 c-NTP主要與誘發(fā)神經(jīng)炎癥及細(xì)胞死亡有關(guān)，參與腦神經(jīng)元的修補與再生，AD患者腦中AD7 c-NTP基因表達(dá)水平異常增高[31]。AD7 C-NTP已被確定為診斷AD的生化指標(biāo)，在AD患者的腦組織和腦脊液中都選擇性升高。與Aβ和Tau蛋白等相關(guān)指標(biāo)相比，AD7 c-NTP變化在AD的更早階段就能檢測到，也許更適合作為AD早期診斷的標(biāo)記物[32]；并且AD7 c-NTP水平變化可以直接通過測定尿液達(dá)到，相對測定腦脊液和血液比較簡便易行，是一種比較有前景成為AD生物標(biāo)記物的蛋白質(zhì)。

4.1.3 載脂蛋白J（ApoJ）。ApoJ又稱為簇集蛋白，由神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌，為腦內(nèi)第二大糖蛋白，存在于血漿HDL和極高密度脂蛋白（vHDL）中。研究發(fā)現(xiàn)ApoJ通過多種途徑在AD的病理生理過程中起保護(hù)作用，通過對AD患者和正常人不同腦區(qū)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)只有AD患者額葉皮質(zhì)和海馬區(qū)ApoJ含量顯著升高，且AD患者血漿中ApoJ含量也升高，表明血漿ApoJ對診斷AD具有一定的特異性和可靠性，有望成為AD生物標(biāo)記物。

4.1.4 補體激活。補體激活在AD發(fā)病機制方面起很重要的作用，是Aβ斑塊的主要成分，在AD早期就已經(jīng)發(fā)生[33]。研究表明在AD患者腦內(nèi)補體基因表達(dá)顯著增加，可在一定程度上用于診斷AD[34]。然而有試驗證實其他神經(jīng)退行性疾病中也發(fā)現(xiàn)補體通路的異常激活，例如年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD），該病可導(dǎo)致視力損害和老年變盲[35]。AMD和AD有共同的病理特征，如Aβ沉積。生化學(xué)研究表明，AMD中的細(xì)胞外玻璃疣包括炎癥中介物，還有與AD相似的補體系統(tǒng)的活性成分[36]。因此補體可能會成為這些疾病進(jìn)程中的生物標(biāo)記物，而是否特異性地作為AD生物標(biāo)記物還需要進(jìn)一步的驗證。

4.2 氧化應(yīng)激相關(guān)的生物標(biāo)記物

氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物堆積，引發(fā)細(xì)胞損傷及神經(jīng)元的凋亡，也是AD發(fā)病的重要危險因素。但是由于對其的定量不好控制，氧化應(yīng)激只能作為一個輔助手段來診斷疾病。有研究顯示晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（Receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）是Aβ的特異性受體，通過與Aβ結(jié)合增強神經(jīng)元氧化應(yīng)激水平，使RAGE表達(dá)增多，尤其在Aβ聚集區(qū)[37]。免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，AD患者大腦RAGEs明顯高于正常人[38]，但也有研究表明AD患者血清RAGE水平低于正常人[39]，因此目前RAGE對于早期AD患者的預(yù)測和診斷的輔助作用還需進(jìn)一步研究證實。

5 影像學(xué)標(biāo)記物

近年來影像學(xué)已經(jīng)廣泛用于AD的診斷和檢查，其中最常用的是磁共振成像（MRI）和正電子發(fā)射型計算機斷層顯像（PET）。依據(jù)此技術(shù)可以清晰地顯示AD患者大腦的結(jié)構(gòu)和功能上的變化，從而進(jìn)行早期AD的診斷。

5.1 MRI影像學(xué)標(biāo)記物

MRI是一種生物磁自旋成像技術(shù)，利用原子核自旋運動，在外加磁場內(nèi)，經(jīng)射頻脈沖激發(fā)后產(chǎn)生信號，用探測器檢測并輸入計算機，經(jīng)過計算機處理轉(zhuǎn)換后在屏幕上顯示圖像，包括結(jié)構(gòu)性 MRI（sMRI）和功能性 MRI（fMRI）。調(diào)查發(fā)現(xiàn)AD患者功能性和結(jié)構(gòu)性MRI異常，如海馬區(qū)和海馬旁回功能活動較強，而楔前葉以及扣帶回后部的活動則受抑制，并且在一些頂葉區(qū)域的灰質(zhì)較薄[40-41]。MRI顯示AD患者的腦部結(jié)構(gòu)的主要改變表現(xiàn)為全腦體積減小，海馬區(qū)和內(nèi)嗅皮質(zhì)萎縮，體積減小。且有報道指出腦內(nèi)這些萎縮變化在AD患者發(fā)生Aβ沉積和記憶丟失、認(rèn)知障礙前20年就已經(jīng)出現(xiàn)，因此MRI成像技術(shù)在早期預(yù)測AD方面有重大意義，能夠盡早地預(yù)防、治療AD[42]。

5.2 PET

PET是一種反映分子代謝的顯像。當(dāng)疾病早期處于分子水平變化階段，病變區(qū)的形態(tài)結(jié)構(gòu)尚未呈現(xiàn)異常，MRI、CT檢查還不能明確診斷時，PET檢查即可發(fā)現(xiàn)病灶所在，并可獲得三維影像，還能進(jìn)行定量分析，達(dá)到早期診斷目的，這是目前其他影像檢查所無法比擬的。PET可用于AD早期診斷與鑒別。目前常用的PET方法主要包括氟代脫氧葡萄糖正電子發(fā)射斷層掃描（FDG-PET）和匹茲堡復(fù)合物B正電子發(fā)射斷層掃描（PIB-PET）[42]。

5.2.1 FDG-PET。葡萄糖是腦的主要能源物質(zhì)。18 FDG是葡萄糖的類似物，F(xiàn)DG-PET可以用于研究AD患者的腦代謝變化。實驗發(fā)現(xiàn)AD患者的18 FDG-PET顯像呈現(xiàn)特征性皮層代謝減低，減低程度和范圍與癥狀嚴(yán)重性呈正相關(guān)，所以FDG-PET可以用來對AD早期進(jìn)行診斷和檢查；然而其特異性不是很高，存在炎癥或缺血情況下也會產(chǎn)生代謝降低的現(xiàn)象，因此作為AD生物標(biāo)記物還有待進(jìn)一步研究證實[42]。

5.2.2 PIB-PET。PIB-PET能與Aβ蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合，因此能評價腦內(nèi)Aβ沉積情況。因為Aβ在腦內(nèi)沉積是AD的一個特異的病理特征，因此PIB-PET在AD診斷方面特異性很強，是一個很有前景的AD生物標(biāo)記物[42]。

6 結(jié)語

目前研究人員已經(jīng)將目光集中在MCI。MCI是正常健康狀態(tài)和早期AD之間的過渡狀態(tài)[43]，每年都有6%～25%的MCI發(fā)展成為AD，MCI記憶丟失的子類型代表AD的前驅(qū)癥狀。因此應(yīng)該準(zhǔn)確地診斷MCI[44]，以此來更早地診斷AD，更加有效地預(yù)防和治療AD。后續(xù)研究應(yīng)努力尋找診斷MCI和AD的有效、合適的生物標(biāo)記物，并且在尋找生物標(biāo)記物時要注意需要標(biāo)準(zhǔn)化和驗證在動物模型和人類研究中的定量測定方法和分析方法。要避免使用單一的標(biāo)記物，對多個不同機制的生物標(biāo)記物進(jìn)行聯(lián)合分析可以確保診斷的準(zhǔn)確度和治療的合理性。

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