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      苦參堿對(duì)人前列腺癌PC-3M細(xì)胞周期與凋亡的影響

      2014-08-14 08:30:32王桂秋
      實(shí)用藥物與臨床 2014年5期
      關(guān)鍵詞:苦參堿前列腺癌染色

      王桂秋

      0 引言

      前列腺癌是一種男性前列腺組織中的惡性腫瘤,其發(fā)病是前列腺腺泡細(xì)胞基因突變導(dǎo)致增殖不受控制的結(jié)果[1]。隨著病情的惡化,前列腺癌還會(huì)擴(kuò)散到鄰近器官,甚至轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端部位,尤其是淋巴結(jié)和骨髓[2]。臨床上,該病的治療包括手術(shù)療法、化學(xué)療法、放射療法、激素療法單一治療或是幾種療法聯(lián)合應(yīng)用[3]。而中藥治療癌癥具有其獨(dú)特的好處,包括低毒、多靶點(diǎn)、藥性溫和等[4]??鄥A提取自豆科植物苦參(Sophora flavescens Ait)的根,具有利尿、抗病原體、抗肝炎、抗炎等作用,以及提高免疫力的藥理活性[5-6]。因此,在當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)中,我們建立體外穩(wěn)定的前列腺癌PC-3M細(xì)胞模型,以細(xì)胞凋亡為研究目標(biāo),進(jìn)一步探討苦參堿的抗腫瘤作用與凋亡相關(guān)通路的內(nèi)在聯(lián)系,為證明其對(duì)PC-3M促凋亡的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 細(xì)胞 人前列腺癌PC-3M細(xì)胞,購(gòu)自上海腫瘤研究所。

      1.1.2 藥物與試劑 苦參堿(純度>98%):Spectrum公司。DMEM培養(yǎng)基:Invitrogen公司。小牛血清:Amersco公司。胰蛋白酶:Amersco公司。0.25%胰酶:Gibco公司。甲基偶氮唑鹽(MTT):Sigma公司。二甲基亞砜(DMSO):南京建成生物工程研究所。PI染色試劑盒:Roche公司。Cyclin D1蛋白抗體:南京建成生物工程研究所。DAB顯色試劑盒:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。p-ERK1/2抗體:Invitrogen公司。蛋白裂解液:南京建成生物工程研究所。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH):Invitrogen公司。

      1.1.3 儀器 Model 311 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma公司)。IX71-A21PH倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。SZX型超凈工作臺(tái)(上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠)。GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司)。JC303A-T電熱恒溫培養(yǎng)箱(成都一恒科技有限公司)。

      1.2 方法

      1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)菌環(huán)境下,培養(yǎng)基RPMI-1640中加入新配置15% FBS、200 μg/mL青霉素、l50 μg/mL鏈霉素(4 ℃保存)。PC-3M細(xì)胞復(fù)蘇后,接種在培養(yǎng)瓶安置CO2培養(yǎng)箱中孵化(37 ℃,5% CO2)。D-Hank′s液沖洗3次,加入5 mL 0.25%的胰蛋白酶液,置37 ℃約10 min。終止消化后,細(xì)胞懸液移入無(wú)菌刻度離心管中,低速離心10 min后消化3次,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟。

      1.2.2 分組及給藥 精密稱(chēng)取苦參堿100 μg,用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的MR終濃度(0、30、60、120 μM),每孔100 μL,同時(shí)設(shè)5個(gè)平行孔/組,重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次,獲取平均值數(shù)據(jù)。應(yīng)用Graphpad Prism軟件計(jì)算IC50(半數(shù)抑制率),即MR治療PC-3M細(xì)胞24、48、72 h后的IC50值。同時(shí)增設(shè)對(duì)照組。細(xì)胞增殖抑制率=(OD對(duì)照-OD治療)/(OD對(duì)照-OD空白)×100%

      1.3 指標(biāo)檢測(cè) MTT法檢測(cè)MR對(duì)PC-3M抑制率,PI染色檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表達(dá),Western blot法檢測(cè)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)磷酸化蛋白水平。

      2 結(jié)果

      2.1 MR給藥后對(duì)PC-3M細(xì)胞抑制作用 MTT法結(jié)果顯示,不同濃度MR抑制PC-3M的作用逐漸增強(qiáng),與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。此外,隨著時(shí)間的增加,MR的抑制作用不斷增強(qiáng),提示MR治療有一定的時(shí)間-劑量依賴(lài)性。見(jiàn)圖1。

      圖1 MR給藥對(duì)PC-3M細(xì)胞增殖的抑制作用

      2.2 MR給藥后對(duì)PC-3M細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)變化的作用 PI染色結(jié)果表明,空白組中PC-3M的細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,輪廓清晰,核仁透亮,核漿比例正常。30 μM濃度MR給藥72 h后,PC-3M細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞質(zhì)空泡增多,核收聚,出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。而經(jīng)過(guò)60、120 μM濃度MR給藥,PC-3M細(xì)胞皺縮、脫落、密度降低,同時(shí)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)增多。見(jiàn)圖2。

      圖2 MR給藥后對(duì)PC-3M細(xì)胞形態(tài)的影響(PI染色,×100)

      2.3 MR給藥后對(duì)PC-3M細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果顯示,空白組中PC-3M細(xì)胞Cyclin D1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較多,處于激活狀態(tài)。經(jīng)MR給藥后,PC-3M細(xì)胞Cyclin D1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少,與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。此外,結(jié)果顯示一定的時(shí)間-劑量依賴(lài)關(guān)系。見(jiàn)圖3。

      圖3 MR給藥抑制PC-3M細(xì)胞Cyclin D1的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色,×100)

      2.4 MR給藥后對(duì)PC-3M細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)的影響 Western blotting結(jié)果顯示,空白組內(nèi)源性p-ERK1/2水平上調(diào),處于過(guò)表達(dá)狀態(tài)。經(jīng)MR給藥后,PC-3M細(xì)胞增加的p-ERK1/2表達(dá)有效地下調(diào),與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示一定的時(shí)間-劑量依賴(lài)性。見(jiàn)圖4。

      3 討論

      前列腺癌是嚴(yán)重危害男性生命的惡性癌癥之一,當(dāng)前主要采用放療、化療、手術(shù)、藥物治療等措施進(jìn)行防治,但都普遍存在預(yù)后差和復(fù)發(fā)性[7]。而傳統(tǒng)中藥在前列腺癌的防治工作方面獲得了有效的進(jìn)步[8]。在本實(shí)驗(yàn)中,MTT結(jié)果表明,在生理狀態(tài)下PC-3M細(xì)胞增殖速度快,提示調(diào)控腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖可以作為治療的方向。MR給藥后,能顯著抑制PC-3M增殖與分化,提示MR具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用。此外,PI染色結(jié)果也說(shuō)明,MR給藥能誘導(dǎo)PC-3M細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化,發(fā)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

      圖4 MR給藥抑制PC-3M細(xì)胞p-ERK1/2的活性

      Cyclin D1是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子之一,不受控制的表達(dá)是原發(fā)性前列腺癌的特征,對(duì)臨床預(yù)后診斷具有重要意義[9]。腫瘤細(xì)胞中,Cyclin D1加速癌細(xì)胞周期素過(guò)度表達(dá),同時(shí)造成CKIs細(xì)胞分裂的蛋白失活,從而加速腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和生長(zhǎng)[10]。免疫組化結(jié)果顯示,PC-3M細(xì)胞內(nèi)源性Cyclin D1過(guò)度表達(dá),說(shuō)明Cyclin D1的異常表達(dá)促進(jìn)了PC-3M細(xì)胞不斷增殖和分化。MR給藥后,能有效抑制PC-3M細(xì)胞Cyclin D1的表達(dá),提示MR通過(guò)抑制PC-3M細(xì)胞Cyclin D1的活性而發(fā)揮抗腫瘤作用,結(jié)果與MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致。

      研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK1/2的生物學(xué)效應(yīng)與細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān),作用機(jī)制與其通過(guò)磷酸化反應(yīng)可調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性,從而引起靶蛋白的活性變化,最終調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝功能[11]。此外,ERK1/2的抗凋亡作用與激活磷酸化抗凋亡分子(如bac-2,Bad等)以及激活轉(zhuǎn)錄因子(如Cyclin D1等)有關(guān)[12]。因此,藥物干預(yù)作用在腫瘤細(xì)胞的ERKl/2靶點(diǎn)有助于抑制其發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)研究表明,PC-3M細(xì)胞內(nèi)源性p-ERKl/2明顯上調(diào)。經(jīng)MR給藥后,PC-3M細(xì)胞p-ERKl/2的表達(dá)被有效地下調(diào),提示MR作用與PC-3M細(xì)胞ERKl/2靶點(diǎn),抑制其生理活性,進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白組件Cyclin D1的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡,故推測(cè)MR抗腫瘤作用與其抑制癌細(xì)胞內(nèi)源性ERK1/2/Cyclin D1通路有關(guān)。

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