缺氧對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞DNA甲基化及組蛋白乙?；嚓P(guān)酶的表達(dá)影響

楊清麟，李 良

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，北京 100069)

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的主要支持成分，也是腦組織中最豐富的膠質(zhì)細(xì)胞類型，具有調(diào)節(jié)腦內(nèi)微環(huán)境和神經(jīng)傳遞等重要功能，并為神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[1]。缺血低氧是機(jī)體常見(jiàn)的一種損傷因素，能量代謝的下降可引發(fā)一系列線粒體呼吸功能障礙，活性氧自由基產(chǎn)生過(guò)多,從而引起細(xì)胞的變性壞死。在缺氧等損傷因素刺激下，星形膠質(zhì)細(xì)胞可發(fā)生活化反應(yīng)，稱為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞(reactive astrocyte)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞增生、形態(tài)學(xué)改變以及相關(guān)蛋白的異常表達(dá)[2,3]。近些年來(lái)表觀遺傳學(xué)的研究成為熱點(diǎn)，所謂表觀遺傳學(xué)是指在DNA序列未改變的基礎(chǔ)上，基因功能發(fā)生可遺傳的表型改變， DNA甲基化和組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)研究的主要內(nèi)容之一。DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶C第5位碳原子上的過(guò)程。目前認(rèn)為，DNMTs家族成員至少包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B四個(gè)亞型[4]。甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白2(methyl-binding domain 2, MBD2)則能發(fā)揮DNA去甲基轉(zhuǎn)移酶的作用。組蛋白的乙酰化水平由組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)共同調(diào)節(jié)。多種具有HAT和HDAC活性的調(diào)節(jié)因子，通過(guò)對(duì)組蛋白乙酰化過(guò)程的調(diào)節(jié)，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。其中CREB綁定蛋白(CREB-binding protein，CBP)就是一個(gè)常見(jiàn)的具有HAT活性的調(diào)節(jié)因子。缺血低氧損傷是否可以通過(guò)表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制影響反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞蛋白的表達(dá)，關(guān)于這方面的研究少有報(bào)道。本研究采用原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察缺氧處理對(duì)DNA甲基化和組蛋白乙?；嚓P(guān)酶表達(dá)水平的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

新生24 h內(nèi)SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(來(lái)源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-0001】)，胎牛血清(杭州四季青)，DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，多聚賴氨酸(poly-L-Lysine,PLL)、核酸染料Hoechst 33258、碘化丙啶(propidium iodide, PI)(美國(guó)Sigma公司),兔抗DNMT1單克隆抗體、兔抗DNMT3A多克隆抗體、兔抗CBP單克隆抗體、兔抗HDAC3單克隆抗體(Cell Signaling公司)，兔抗MBD2多克隆抗體(Santa Cruz公司)，鼠抗β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒(Pierce公司)，GFAP、DAPI(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 方法

1.2.1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)：新生24 h內(nèi)的SPF級(jí)SD大鼠，冷凍麻醉, 75%乙醇消毒，斷頭，取出兩側(cè)大腦半球置于冰的PBS中，在體視顯微鏡下剝離腦膜并分離出大腦皮質(zhì)，剪碎后加入適量胰酶37℃消化5 min，終止消化后小心吹打，經(jīng)200目篩網(wǎng)濾過(guò), 將濾液離心5 min(1000 r/ min)，棄上清，將用含10%胎牛血清DMEM/ F12培養(yǎng)基重懸后的懸液接種至培養(yǎng)瓶中，差速貼壁1 h后將上清離心5 min(1000 r/ min), 重懸后接種于用多聚賴氨酸預(yù)處理的培養(yǎng)瓶中。每2～3 d換液1次, 待第9～14天左右細(xì)胞長(zhǎng)滿后，固定于恒溫?fù)u床(37℃, 250 r /min)震蕩18 h，舍棄含脫落細(xì)胞的細(xì)胞懸液，以去除少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，PBS清洗后消化傳代，第三代細(xì)胞用細(xì)胞免疫熒光法標(biāo)記神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞純度在95%以上，可以使用。

1.2.2 缺氧處理：培養(yǎng)細(xì)胞分為對(duì)照組和缺氧模型組。缺氧模型組的細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)處理，將正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞棄掉原培養(yǎng)液，PBS沖洗兩遍，加入5%胎牛血清，2.78 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基后，放入37℃，2% O2，5% CO2，85%濕度條件下分別培養(yǎng)24 h，48 h和72 h。

1.2.3 Western blot檢測(cè)：收集細(xì)胞后加入全細(xì)胞裂解液提取蛋白，13000 r/min, 離心10 min后取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度并制備電泳蛋白樣品，分別用8%或10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用脫脂牛奶室溫封閉1 h后分別加入一抗DNMT3A(1∶1000 ), DNMT1(1∶1000 ), MBD2(1∶200 ), CBP(1∶1000),HDAC3 (1∶1000 )，4℃過(guò)夜。TTBS沖洗后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h加入ECL發(fā)光試劑后在暗室曝光。所得X-線膠片用Gel-Doc凝膠成像系統(tǒng)掃描，應(yīng)用ImageJ分析軟件對(duì)各組條帶進(jìn)行半定量分析，計(jì)算各蛋白條帶總吸光度A值與相應(yīng)內(nèi)參總吸光度A值的比值。

1.2.4 細(xì)胞活性測(cè)試：原代培養(yǎng)第三代的星形膠質(zhì)細(xì)胞分別缺氧處理24 h，48 h，72 h后，吸去原培養(yǎng)基，PBS浸洗3次，加培養(yǎng)液和Hoechst染液(Hoechst 染液終濃度為5 μg/mL), 37℃, 5%CO2孵箱中孵育15 min后取出, PBS液洗滌3次, 加PBS液和PI染液((PI染液終濃度為10 μg/mL), 室溫靜置10 min, PBS洗滌，熒光顯微鏡下觀察，照像，每個(gè)小皿在40倍視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，每組計(jì)數(shù)4個(gè)小皿，計(jì)算死亡細(xì)胞百分比(細(xì)胞死亡率=死亡細(xì)胞數(shù)/所有細(xì)胞數(shù)*100%)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定

培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)兩次傳代后，用小鼠抗GFAP(glial fibrillary acidic protein,膠質(zhì)纖維酸性蛋白，被普遍認(rèn)為是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物)的單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色，經(jīng)過(guò)鑒定證實(shí)為星形膠質(zhì)細(xì)胞，陽(yáng)性率達(dá)95%以上(彩插8圖1)。

2.2 細(xì)胞活性檢測(cè)

采用Hoechst33258/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞活性，PI標(biāo)記壞死的細(xì)胞(圖2中紅色熒光所示)，Hoechst33258標(biāo)記所有的細(xì)胞核(圖2中藍(lán)色熒光所示)。星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧24 h后，對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有明顯影響，細(xì)胞死亡率僅從對(duì)照組的1.5%(彩插8圖2A)增加到2.3%(彩插8圖2B)；細(xì)胞缺氧48 h后，細(xì)胞死亡率為4.7%(彩插8圖2C)，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明這時(shí)缺氧對(duì)細(xì)胞造成了一定的損傷；細(xì)胞缺氧72 h后，細(xì)胞死亡率與對(duì)照組相比差異性顯著，達(dá)到8.6%(彩插8圖2D)。

2.3 DNA甲基化相關(guān)酶的表達(dá)

星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)缺氧處理48 h后，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A、DNMT1的表達(dá)分別比對(duì)照組增加了49%和83%，而去甲基轉(zhuǎn)移酶MBD2的表達(dá)比對(duì)照組減少了36% (圖3)。

2.4 組蛋白乙酰化相關(guān)酶的表達(dá)

星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)缺氧處理48 h后，組蛋白去乙?；窰DAC3的表達(dá)增高，為對(duì)照組的2.1倍，而組蛋白乙酰化酶的表達(dá)顯著上升，增高至對(duì)照組的20倍(圖4)。

3 討論

越來(lái)越多的研究顯示，缺血低氧性腦損傷可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞異常蛋白的表達(dá)，在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[5-8]，那么表觀遺傳學(xué)機(jī)制是否參與蛋白表達(dá)的調(diào)控？本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)缺氧處理48 h后，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1和DNMT3A表達(dá)水平增高。 DNMT1是1955年Bestor等[9]從真核生物中克隆出來(lái)的第一個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，它的主要作用是維持原有DNA 甲基化，這種維持作用可以將DNA甲基化信息傳遞給子代細(xì)胞, 并且在細(xì)胞分裂過(guò)程中起最主要的穩(wěn)定維持甲基化狀態(tài)的作用[10-11]。DNMT3又稱從頭甲基化酶，在未甲基化的基因組序列中催化CpG二核苷酸甲基化[12]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩種DNMT水平均有升高，提示缺氧不僅可以維持原有DNA甲基化水平，同時(shí)還可以誘導(dǎo)新位點(diǎn)發(fā)生甲基化。DNA甲基化的發(fā)生和甲基化程度的高低取決于DNMTs及去甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)中星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧后DNMT表達(dá)增高的同時(shí)DNA去甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平下降，提示缺氧可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞DNA甲基化水平的增高。目前關(guān)于缺氧誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞DNA甲基化水平改變尚無(wú)報(bào)道，而關(guān)于其它細(xì)胞缺氧及腦組織缺氧后的DNA甲基化水平及相關(guān)酶的改變，研究結(jié)果報(bào)道也并不一致。Jae-Chul L等[13]對(duì)沙鼠進(jìn)行腦缺血處理，發(fā)現(xiàn)DNMT1在海馬CA1區(qū)的表達(dá)下降；Yoka A等[14]使用Hela細(xì)胞進(jìn)行缺氧實(shí)驗(yàn)，顯示DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基轉(zhuǎn)移酶活性均沒(méi)有改變，缺氧也未影響其全基因組甲基化水平；Ying W等[15]使用大鼠腦組織發(fā)現(xiàn)缺氧后DNA甲基化水平明顯升高。此外，本課題組之前采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法(two-vessel occlusion, 2-VO)制備腦血流低灌注模型，發(fā)現(xiàn)缺血/低氧的大鼠腦組織早期(術(shù)后10 d，30 d)全基因組甲基化水平明顯下降，而后期(術(shù)后90 d，180 d)又明顯升高。

注：A為蛋白印跡圖；B為蛋白表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖；*示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：P < 0.05。

注：A為蛋白印跡圖；B為蛋白表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖；*示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05；**示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性P<0.01。

缺氧對(duì)組蛋白乙?；降挠绊懸灿幸恍┫嚓P(guān)報(bào)道，Annamaria L等[16]采用原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元進(jìn)行氧糖剝奪處理，發(fā)現(xiàn)組蛋白H3的乙?；浇档?；Huaping S等[17]用原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行急性缺氧處理，發(fā)現(xiàn)HAT活性升高，而HDAC在急性缺氧1 h時(shí)明顯活性升高，缺氧4 h后又比急性缺氧1 h時(shí)有所下降，組蛋白H3的乙?；缴撸籕in L等[18]使用細(xì)胞系進(jìn)行缺氧處理后發(fā)現(xiàn)組蛋白H4的乙?；揭灿兴档?。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示缺氧后HDAC表達(dá)雖有增高，但HAT的增高卻更加明顯。HAT通過(guò)在組蛋白N端賴氨酸殘基引入乙?；?，使其乙?；?，激活轉(zhuǎn)錄基因從而促使基因表達(dá)，而HDAC則通過(guò)使組蛋白去乙酰化來(lái)抑制基因轉(zhuǎn)錄。組蛋白乙酰化和去乙?；c基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)，HAT和HDAC之間的動(dòng)態(tài)平衡控制著染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中HAT表達(dá)的增高是HDAC增高水平的將近10倍，可能促進(jìn)某些基因的表達(dá)，在缺氧性腦損傷中發(fā)揮相應(yīng)的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞DNA甲基化水平升高，組蛋白乙?；揭餐瑫r(shí)升高。DNA甲基化會(huì)抑制基因的表達(dá)，而組蛋白乙?；纱龠M(jìn)基因的表達(dá)，這兩組結(jié)果看似矛盾。事實(shí)上基因組甲基化水平并不能夠代表某個(gè)特殊基因甲基化水平，如老年人常表現(xiàn)有基因組的低甲基化，然而腫瘤病患者卻有某些抑癌基因的高甲基化；同樣組蛋白的修飾除乙?；?，還有甲基化、泛素化、磷酸化等修飾方式綜合調(diào)控基因的表達(dá)。因此，針對(duì)某一特定基因的表達(dá)，還應(yīng)綜合各方面因素全面考慮。

以上結(jié)果表明，缺氧可以影響星形膠質(zhì)細(xì)胞DNA甲基化和組蛋白乙?；嚓P(guān)酶的水平，并可能引起表觀遺傳學(xué)的改變，影響相關(guān)基因的表達(dá)，從而在缺血性腦損傷中發(fā)揮作用。

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