LLNA:BrdU-ELISA改良法的建立及其在化妝品安全性評價中的應用

胡培麗，羅飛亞，陳志蓉, 邢書霞

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

皮膚致敏繼而導致接觸過敏性皮炎是一種有關職業(yè)衛(wèi)生及消費者健康的重要問題，評價化學物質及產品的皮膚致敏性可以有效地防止接觸過敏性皮炎的發(fā)生。小鼠局部淋巴結試驗(local lymph node assay, LLNA)是目前檢測化學物致敏性的最新替代方法，該方法減少了實驗動物，靈敏快速，結果客觀敏感，已被歐洲經(jīng)濟發(fā)展與合作組織(organization for economic co-operation and development, OECD)、歐洲替代試驗驗證中心(european center for the validation of alternative method, ECVAM)、美國環(huán)保署(United States Environmental Protection Agency, USEPA)和中國等采納為標準實驗方法[1-4]。但該方法需要使用放射性標記物、特定的設備和實驗條件，不利于推廣。TAKEYOSHI等[5-6]建立了基于摻入溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的LLNA方法，已通過實驗室間認證并于2010年被歐洲經(jīng)濟發(fā)展與合作組織(OECD)采納[7]。目前我國該方法的相關研究報道還較少，本研究旨在建立一種可快速檢測化學物致敏性和刺激性的LLNA:BrdU-ELISA改良法，從而進一步評價化妝品產品。

1 材料和方法

1.1 受試物

AOO 溶劑：由丙酮：橄欖油=4:1(v/v)配制而成，致敏陽性劑：2,4二硝基氯苯(DNCB，中國醫(yī)藥總公司北京分公司)，用AOO配成0.1% (w/v)、0.3% (w/v)、1.0% (w/v) 3個濃度；丁子香酚(EUG, Sigma公司)，己基肉桂醛(HCA, Sigma公司)，均用AOO配制成25% (v/v)和50% (v/v) 2個濃度；3種化妝品原液直接涂抹于小鼠耳背皮膚。

1.2 實驗動物

SPF級BALB/c小鼠，雌性，8～10周齡，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心【SCXK(京)2009-0017】。動物試驗環(huán)境條件為屏障系統(tǒng)動物房【SYXK(京)2011-0008】，溫度22±2℃，濕度50%～70%，動物自由飲食，12 h人工照明。

1.3 試劑和儀器

BrdU-ELISA試劑盒、BrdU粉劑均購自德國Roche公司(編號11647229001、10280879001)。BrdU標記液用生理鹽水配制成濃度10 mg/mL。CR22G III型低溫離心機(日本HitacHi公司)、SYNERGY HT型全自動酶標儀(美國BIO TEK 公司)，千分尺(Mitutoyo 公司)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組和染毒[7-8]

動物隨機分組，每組4只小鼠，分別設溶劑對照組(AOO/蒸餾水)、陽性對照組(2,4二硝基氯苯、己基肉桂醛、丁子香酚)和3種化妝品。將受試物25 μL/耳/d，連續(xù)3 d涂抹于小鼠雙耳背部皮膚，溶劑對照組涂抹相應的溶劑，第4天不處理，第5天腹腔注射0.5 mL BrdU標記液，第6天分離耳部淋巴結。

1.4.2 耳緣厚度測量

分別于首次給藥前和末次給藥后約24 h，用千分尺測量小鼠耳緣厚度，第6天處死動物后，取小鼠耳緣直徑9 mm的組織稱重。

1.4.3 淋巴細胞懸液的制備

腹腔注射BrdU標記液后24 h處死動物，摘取小鼠耳部淋巴結，用萬分之一天平稱重，在PBS中研磨，200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，制成單細胞懸液，用PBS洗2次，離心(1200 r/min, 8 min)，將每只小鼠的淋巴細胞定容于14 mL PBS中。

1.4.4 ELISA檢測淋巴細胞增殖

將細胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，100 μL/孔，1400 r/min 離心10 min，棄上清，吹干細胞。用ELISA試劑盒檢測BrdU值：每孔加200 μL變性固定液，常溫放置30 min, 輕拍完全后棄去變性液；加入100 μL抗-BrdU抗體工作液，常溫孵育90 min;棄去未結合的抗體工作液，加入240 μL PBS洗液，洗3次，輕拍去除洗液；加底物顯色液100 μL、常溫孵育20 min，用酶標儀檢測吸光度(A)值(發(fā)射波長和參考波長分別為370 nm，492 nm)，BrdU標記指數(shù)為(A370-A空白370)-(A492-A空白492)。

1.4.5 SI、EC1.6的計算與致敏性分級

刺激指數(shù)( stimulation index，SI)是受試物組與溶劑對照組的比值，即SI=受試物組BrdU標記指數(shù)均值/溶劑對照組BrdU標記指數(shù)均值；SI≥1.6，該受試物為致敏陽性，但對于SI為 1.6～1.9的邊緣結果，仍需考慮劑量-效應關系、系統(tǒng)性毒性或過度刺激等癥狀[7-8]。根據(jù)SI值計算EC1.6，即SI等于1.6時受試物的濃度，并根據(jù)EC1.6值進行致敏級別判定。計算公式為：①EC1.6=c+[(1.6-d)/(b-d)]×(a-c)(受試物各濃度組對應SI值包括>1.6和<1.6)，②EC1.6=2^{log2(c)+[(1.6-d)/(b-d)]×[log2(a)-log2(c)]}(受試物各濃度組對應SI值均>1.6)，其中設a、c為鄰近兩點受試物的濃度，b、d為對應的SI值；當SI=1.6時，其對應的受試物濃度即為EC1.6值[8]。分級標準為：EC1.6<0.1極強，0.1≤EC1.6<1.0強，1.0≤EC1.6<10中,10≤EC1.6<100弱[8]。

1.4.6 LLNA:BrdU-ELISA法結果與文獻、經(jīng)典動物法比較

2,4二硝基氯苯、丁子香酚和己基肉桂醛的檢測結果與相關文獻比較，3種化妝品同時進行豚鼠局部封閉涂皮試驗(BT)和家兔多次皮膚刺激性試驗[9]，將數(shù)據(jù)與本實驗數(shù)據(jù)進行比較。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 染毒期間動物狀態(tài)觀察

染毒期間動物飲食正常，體重增長良好。部分組別小鼠染毒部位見有水腫、紅斑或結痂刺激性或致敏性癥狀，各臟器未見有任何病變，未觀察到明顯的其他毒性情況。

2.2 LLNA:BrdU-ELISA法測定結果

由表1可見刺激性指標：DNCB(1.0%)、HCA(25%、50%)和3號粉底霜的耳腫脹和耳廓重顯著增加(P< 0.05或P< 0.01)，判斷可能為刺激物；其他組與對照組比較(DNCB、EUG與AOO組比較，1、2號精華霜與蒸餾水組比較)，差異均無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。

由表2可見致敏性指標：3種化學物(所有濃度)淋巴結重量與AOO組比較，均有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)；3號粉底霜淋巴結重量與蒸餾水組比較顯著增加(P< 0.01)；SI均大于1.6(1.9)。1、2號精華霜組淋巴結重量與蒸餾水組比較無明顯差異(P> 0.05)，且SI均小于1.6。致敏性分級結果為：DNCB為極強致敏物，EUG和HCA為中等強度致敏物。

2.3 LLNA:BrdU-ELISA法、BT法與多次皮膚刺激性試驗法對3種化妝品的致敏性和刺激性檢測結果

由表3可見,1、2號精華霜試驗結果均為無刺激性、無致敏性；3號粉底霜LLNA:BrdU-ELISA法結果為有刺激性和致敏性，多次皮膚刺激性試驗結果為有刺激性，BT試驗結果為無致敏性。

表1 3種化學物和3種化妝品的皮膚刺激性檢測結果表

表2 3種化學物和3種化妝品的皮膚致敏性檢測結果表

表3 LLNA:BrdU-ELISA法、BT法與皮膚刺激性試驗法對3種化妝品的皮膚刺激性和致敏性檢測結果

3 討論

目前國內《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中關于化妝品致敏性的檢測方法是豚鼠最大值試驗(GPMT)及局部封閉涂皮試驗(BT)，但檢測周期長、操作復雜、動物數(shù)量多、結果評判主觀性強[9]。隨著新型化妝品、日用物品等新型化學合成物大量上市，開發(fā)可靠的動物替代實驗進行評估化學物毒性迫在眉睫。小鼠局部淋巴結法(LLNA)用小鼠代替豚鼠，動物量少，檢驗周期減短，同時可定量檢測受試物致敏性，結果客觀。近來國內也有些關于LLNA方法的研究報道，如放射法，或用MTT、BrdU替代等[10-13]。本研究建立的LLNA:BrdU-ELISA改良法，可用于全面評價化學物、化妝品原料及產品的皮膚刺激性和致敏性。

國際上有研究發(fā)現(xiàn)，刺激物和致敏物均可對淋巴細胞產生增殖作用，從而致使LLNA產生假陽性[14-15]。目前有研究通過分析淋巴細胞B220+、CD3+、CD4+表型增強LLNA方法的特異性[16-18]，也有增選刺激性指標(耳厚差、耳重)對化學物的致敏性和刺激性進行評價[19-22]。本研究不僅對淋巴結重量、刺激指數(shù)(SI)和EC值等致敏性指標進行分析，同時還測量耳厚差和耳重刺激性指標，從而全面評價化學物的刺激性和致敏性；但是致敏假陽性仍需通過細胞分型等技術進一步判定；此外一些含有特殊結構的化學物質可能會影響該方法的識別能力，從而干擾方法的準確性，需用傳統(tǒng)的豚鼠試驗評價其致敏性[7]。

3.1 3種化學物與有關文獻的比較

2,4二硝基氯苯(DNCB)、丁子香酚和己基肉桂醛均是已知的皮膚致敏物[7-8]，本實驗中經(jīng)LLNA檢測結果均為陽性，根據(jù)EC1.6值致敏性分級與有關文獻報道一致[8]。高劑量DNCB和HCA可引起小鼠耳部皮膚紅腫或結痂，耳緣厚度與耳重明顯增加(P< 0.05)，表明高劑量DNCB(1%)和HCA(25%、50%)對皮膚有刺激性，與有關文獻報道一致[8]。

3.2 LLNA: BrdU-ELISA法、BT法與皮膚刺激試驗法對3種化妝品的致敏性和刺激性檢測結果

1、2號精華霜BT法與皮膚刺激試驗檢測結果均為無刺激性、無致敏性，結果與LLNA法一致。3號粉底霜BT法與皮膚刺激試驗檢測結果為有刺激性、無致敏性，但LLNA法結果為有刺激性和致敏性，致敏性判斷不一致，我們分析其中的可能原因為：(1)BT試驗中陽性致敏物DNCB的誘導濃度為3%，激發(fā)濃度為1.5%；而LLNA方法0.1% DNCB即可使小鼠淋巴細胞明顯增殖(P< 0.05)，表明LLNA方法對化學物的致敏性判斷可能更靈敏，這與有關報道一致[20]；(2)刺激性引起淋巴細胞增殖從而導致的致敏假陽性，有待于進一步分析淋巴細胞表型，值得深入研究。

綜上，LLNA: BrdU-ELISA改良法操作簡單、快速，結果客觀，可較好地評價化學物和化妝品產品的皮膚刺激性和致敏性，有望在化妝品安全性評價中推廣應用。

參考文獻：

[1] OECD. OECD guideline for the testing of chemicals No. 429: Skin sensitisation: Local lymph node assay[S]. OECD Paris, 2002. http://www.oecd.org/env/ehs/testing/45124696.pdf.

[2] McGarry HF.The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH[J]. Toxicology, 2007, 238 (2): 71-89.

[3] United States Environmental Protection Agency (USEPA)．Heath effects test guidelines, OPPTs 870, 2600: skin sensitization[S]. USA: EPA, 2003．

[4] 中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會．GB/T 21827-2008 化學品皮膚變態(tài)反應試驗局部淋巴結方法[S]. 北京：中國標準出版社，2008．

[5] Takeyoshi M, Yamasaki K, Yakabe Y,etal. Development of non-radio isotopic endpoint of murine local lymph node assay based on 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) incorporation [J]. Toxicology letters, 2001, 119(3): 203-208.

[6] Takeyoshi M, Sawaki M, Yamasaki K,etal. Assessment of statistic analysis in non-radioisotopic local lymph node assay (non-RI-LLNA) with α-hexylcinnamic aldehyde as an example[J]. Toxicology, 2003, 191(2): 259-263.

[7] OECD.OECD guideline for the testing of chemicals No. 442B: Skin sensitization: Local lymph node assay: BrdU-ELISA [S]. OECD Paris, 2010. http://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/suppdocs/feddocs/oecd/oecd-tg442b.pdf.

[8] ICCVAM. Test Method Evaluation Report: The Murine Local Lymph Node Assay: BrdU-ELISA, a Nonradioactive Alternative Test Method to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products [R]. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. NIH Publication, 2010. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm.

[9] 中華人民共和國衛(wèi)生部. 化妝品衛(wèi)生規(guī)范[S]. 北京：軍事醫(yī)學科學出版社，2007: 102-105.

[10] 劉協(xié)，呂中明，施偉慶，等．BALB/c和ICR小鼠用于局部淋巴結試驗的研究[J]. 江蘇預防醫(yī)學, 2009, 20(1): 4-6．

[11] 王宗惠，劉怡娜，蘇英，等．一種改進的局部淋巴結試驗-噻唑藍法[J]．毒理學雜志，2003, 17(4): 257-258.

[12] 高珊, 馬玲, 童英, 等. 小鼠局部淋巴結分析試驗替代豚鼠皮膚變態(tài)反應試驗[J]. 毒理學雜志, 2010, 24(4): 297-299.

[13] 何國群，楊杏芬，鄭穗生，等. 溴脫氧尿嘧啶核苷摻入法作為皮膚致敏試驗替代方法研究[J]. 中國職業(yè)醫(yī)學, 2011,38(5): 377-380.

[14] Kirk M K, Broomhead Y, DiDonato L,etal. Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances [J]. SOT Congrees 2007, 2007: 1896-1904.

[15] Sailstad D M. Murine local lymph node assay: An alternative test method for skin hypersensitivity testing [J]. Lab animal, 2002, 31(7): 36-41.

[16] Jung K M, Jang W H, Lee Y K,etal. B cell increases and ex vivo IL-2 production as secondary endpoints for the detection of sensitizers in non-radioisotopic local lymph node assay using flow cytometry [J]. Toxicology letters, 2012, 209(3): 255-263.

[17]. Anderson S E, Umbright C, Sellamuthu R,etal. Irritancy and allergic responses induced by topical application of ortho-phthalaldehyde [J]. Toxicological Sciences, 2010, 115(2): 435-443.

[18]. Lv L, Yan G Y, Zhao Y L,etal. Investigation of the dermal sensitizing potential of traditional medical extracts in local lymph node assays [J]. Experimental Biology and Medicine, 2009, 234(3): 306-313.

[19] 陽曉燕, 趙康峰, 孔建, 等. 局部淋巴結改良法在化妝品皮膚刺激性和致敏性檢測中的應用[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2013, 30 (4): 312-316.

[20] Ehling G, Hecht M, Heusener A,etal. An European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round [J]. Toxicology, 2005, 212(1): 60-68.

[21] Hans-Werner V, Jürgen A H. The local lymph node assay being too sensitive? [J]. Archives of toxicology, 2005, 79(12): 721-728.

[22] Homey B, von Schilling C, Blümel J,etal. An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions [J]. Toxicology and applied pharmacology, 1998, 153(1): 83-94.