HO-1高表達(dá)對脂肪干細(xì)胞在低氧無血清條件下的保護作用及機制*

周中新， 程 軼， 代傳忠， 武維恒

(徐州醫(yī)學(xué)院 1附屬醫(yī)院胸心外科， 2心血管研究所，江蘇 徐州 221002；3徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 徐州 221006)

脂肪干細(xì)胞(adipose tissue-derived stromal cells，ADSCs)是具有自我更新能力，且在適宜微環(huán)境下具有多向分化潛能的原始細(xì)胞，在心肌梗死后可直接或間接對損傷的心肌組織進行細(xì)胞補充或組織修復(fù)。但是在心肌梗死灶缺血缺氧環(huán)境下，脂肪干細(xì)胞的存活率較低,影響其對心肌組織的修復(fù)作用。血紅素氧合酶 1(heme oxygenase 1，HO-1)具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤性增殖效應(yīng)，能產(chǎn)生對傷害性刺激的適應(yīng)和保護性反應(yīng)。本實驗通過鈷原卟啉(cobalt protoporphyrin，Copp)誘導(dǎo)ADSCs表達(dá)內(nèi)源性HO-1，探討內(nèi)源性HO-1在低氧無血清條件下對ADSCs的保護作用及可能的分子機制。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF級雄性SD大鼠，3周齡，體質(zhì)量180～200 g，徐州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

2 主要試劑

HO-1抑制劑鋅原卟啉(Zinc protoporphyrin，Znpp，Strem)；HO-1誘導(dǎo)劑Copp(Frontier)；Ⅰ型膠原酶(Gibco)；NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白 (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC) 兔多克隆抗體(Santa Cruz)； cleaved caspase-1兔多克隆抗體(Cell signaling)；anti-HO-1兔多克隆抗體(Abcam)；β-actin蛋白兔多克?、窨?碧云天)；IRDye 680標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗、IRDye 800CW標(biāo)記的山羊抗小鼠Ⅱ抗(Invitrogen)；細(xì)胞內(nèi)活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 熒光探針 (DCFH-DA) 購于Sigma 公司；IL-1β ELISA 檢測試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司；其余所有試劑均為化學(xué)分析純。

3 方法

3.1ADSCs的分離、培養(yǎng) 、鑒定 參照本課題組已發(fā)表文章[1]。

3.2Copp誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的濃度曲線 將ADSCs調(diào)整密度為1×105cells/L，接種在培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長至培養(yǎng)皿底面80%時，隨機分為5組，分別加入含濃度為0、5、10、15、20 μmol/L Copp的完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h，提取總蛋白。Western blotting法檢測各組HO-1蛋白水平。

3.3低氧無血清條件下ADSCs的實驗分組 正常對照(control) 組：ADSCs在含完全培養(yǎng)基中常氧(37 ℃、21% O2、5%CO2)條件下培養(yǎng)；低氧無血清(serum-free and oxygen deprivation,SOD)組：用無血清的L-DMEM培養(yǎng)基在低氧(37 ℃，1% O2、5%CO2)條件下培養(yǎng)6 h；Copp組：將ADSCs在含濃度為20 μmol/L Copp的完全培養(yǎng)基常氧培養(yǎng)24 h后，再進行低氧無血清處理6 h；Znpp組: 將ADSCs在含濃度為20 μmol/L Copp和20 μmol/L Znpp的完全培養(yǎng)基常氧培養(yǎng)24 h后，再進行低氧無血清處理6 h。

3.4DAPI染色檢測細(xì)胞凋亡率 ADSCs吸去培養(yǎng)基；4%多聚甲醛固定，雙蒸水沖洗；加入DAPI染色液(工作液)常溫避光孵育10 min；吸去DAPI染色液，雙蒸水沖洗；熒光顯微鏡下觀察拍照，每組樣本隨機選取6個視野計數(shù)細(xì)胞總數(shù)及核變性、縮小、凋亡小體等凋亡細(xì)胞數(shù)；凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

3.5胞質(zhì)蛋白的提取 收集細(xì)胞加1 mL冰冷的胞質(zhì)提取液，超聲破碎，懸濁液置于低溫離心機中在4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清，再次4 ℃、12 000 r/min離心30 min，上清為胞漿成分。BCA法測蛋白濃度分裝，置-80 ℃冰箱待用。

3.6Western blotting檢測蛋白水平 取50 μL蛋白量樣品，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，以半干電轉(zhuǎn)移法將凝膠內(nèi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上；將硝酸纖維膜放入封閉液中，室溫1 h；用封閉液適量稀釋的1抗4 ℃孵育過夜；Washing buffer洗膜，加入IRDye800CW或IRDye680標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫避光孵育1 h；Washing buffer洗膜，用濾紙吸去水分；用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描條帶。

3.7ELISA 法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β含量 脂肪干細(xì)胞按分組處理6h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液, 1500 r/min離心，取上清，ELISA法測定IL-1β 濃度。在450 nm波長讀取吸光度(absorbance,A)值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。

3.8細(xì)胞ROS水平測定 脂肪干細(xì)胞按分組處理6 h后，棄去上清液，PBS 清洗3遍，加入DCFH-DA (5 μmol/L)， 37 ℃避光孵育30 min，用PBS清洗2遍，TECAN 多功能酶標(biāo)儀 (激發(fā)和吸收波長分別為488 nm 和525 nm) 讀取熒光光強度，結(jié)果用熒光強度(AU)表示。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，使用SPSS 16.0分析軟件處理，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CoPP可誘導(dǎo)ADSCs內(nèi)源性HO-1的表達(dá)

正常條件下ADSCs不表達(dá)HO-1或者表達(dá)量很低，以至于Western blotting法無法檢測到，而5 μmol/L濃度CoPP進行誘導(dǎo)后，ADSCs開始有少量HO-1表達(dá)。10 μmol/L濃度時，HO-1蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.05)。CoPP對HO-1的誘導(dǎo)作用呈濃度依賴性，20 μmol/L組對HO-1誘導(dǎo)作用最強,見圖1。

Figure 1. The expression of endogenous HO-1 in ADSCs induced by different concentrations of CoPP. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs 0 μmol/L group.

2 CoPP可誘導(dǎo)低氧無血清條件下ADSCs 中HO-1高表達(dá)

Western blotting 檢測結(jié)果分析顯示，低氧無血清可輕度誘導(dǎo)ADSCs中HO-1的表達(dá)，給予CoPP預(yù)處理后HO-1的表達(dá)顯著升高(P<0.05)；CoPP誘導(dǎo)的HO-1高表達(dá)可被ZnPP逆轉(zhuǎn)(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. Effects of Copp on HO-1 expression in ADSCs exposed to serum-free and oxygen deprivation. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs SOD group; △P<0.05 vs CoPP group.

3 HO-1的高表達(dá)可顯著抑制低氧無血清條件下ADSCs的細(xì)胞凋亡率

DAPI染色結(jié)果顯示，對照組可見正常細(xì)胞的胞核呈均勻的藍(lán)色熒光，大小、形態(tài)較一致，ADSCs凋亡率為(4.09±1.26)%；SOD組可見部分細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核濃縮，個別可見凋亡小體(箭頭所指)，凋亡率為(28.91±2.57)%；CoPP組凋亡率為(15.17±1.40)%；ZnPP組凋亡率為(28.40±2.36)%。對照組與SOD、CoPP、ZnPP組凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CoPP組與SOD、ZnPP組凋亡率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

Figure 3. Effects of CoPP expression on the cell apoptotic rates of ADSCs exposed to serum and oxygen deprivation by DAPI staining. A: control group; B: SOD group; C：CoPP group； D： ZnPP group. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs SOD group and CoPP group.

4 HO-1的高表達(dá)可抑制低氧無血清條件下ADSCs 中NLRP3炎性小體的激活

Western blotting 法定量結(jié)果分析顯示，與對照組比較，低氧無血清條件下NLRP3、ASC 和cleaved caspase-1(即活性caspase-1)蛋白水平明顯升高(均P<0.05)；與SOD組比較，CoPP可明顯抑制低氧無血清誘導(dǎo)的ADSCs 中NLRP3、ASC 和cleaved caspase-1蛋白水平(均P<0.05)，表明CoPP可抑制低氧無血清條件下脂肪干細(xì)胞NLRP3 炎癥小體激活；CoPP產(chǎn)生的上述效應(yīng)可被ZnPP逆轉(zhuǎn)(均P<0.05)，見圖4。

Figure 4. Effects of CoPP on NLRP3, ASC and cleaved caspase-1 expression levels in ADSCs exposed to serum-free and oxygen deprivation (SOD). Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs SOD and ZnPP groups.

5 HO-1高表達(dá)可減少低氧無血清條件下ADSCs 分泌 IL-1β

ELISA檢測顯示，正常培養(yǎng)條件下ADSCs 培養(yǎng)上清液中IL-1β量極低；與對照組比較，低氧無血清條件下ADSCs 培養(yǎng)上清液中IL-1β水平顯著升高(P<0.05)；與SOD組比較，CoPP可明顯減少ADSCs培養(yǎng)上清液中IL-1β水平(P<0.05)，表明CoPP對低氧無血清條件下ADSCs 分泌IL-1β具有明顯的抑制作用；CoPP產(chǎn)生的上述效應(yīng)可被ZnPP逆轉(zhuǎn)(P<0.05)，見表1。

6 HO-1高表達(dá)可減少低氧無血清條件下ADSCs 中ROS 的生成

如表1所示，正常培養(yǎng)條件下ADSCs 中ROS水平極低；與對照組比較，SOD組細(xì)胞內(nèi)ROS 水平明顯升高(P<0.05)；與SOD組比較，CoPP能明顯抑制低氧無血清處理誘導(dǎo)的ADSCs內(nèi)ROS 水平(P<0.05)；同時CoPP的上述效應(yīng)可被ZnPP逆轉(zhuǎn)(P<0.05)。

討 論

近年來的動物實驗和臨床研究均證實，干細(xì)胞心臟移植能不同程度地改善心梗后心臟功能[2]，但改善程度有限，其可能原因是移植的干細(xì)胞在惡劣的梗死心肌環(huán)境下較低的生存率[3]。冠狀動脈堵塞，心肌梗死區(qū)域缺血缺氧、自由基的大量產(chǎn)生，炎性細(xì)胞浸潤、細(xì)胞毒性因子積聚，鈣反常等因素造成移植的干細(xì)胞在惡劣的梗死心肌微環(huán)境下的生存率較低。所有這些因素不僅可以引起移植細(xì)胞的不可逆性缺血損傷，還可以啟動凋亡程序，誘發(fā)移植細(xì)胞凋亡。因此，進一步促進移植的干細(xì)胞存活，減少移植后的凋亡，是提高心功能改善程度的關(guān)鍵步驟。

表1 CoPP對低氧無血清條件下ADSCs分泌IL-1β及細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響

HO-1又稱血紅素加氧酶-1，是血紅素代謝的限速酶，可分解血紅素生成一氧化碳、膽紅素和游離鐵。HO-1分布在全身多處組織和器官中，生理情況下，哺乳動物體內(nèi)呈低水平表達(dá)，但可以被多種刺激物包括氧化損傷所誘導(dǎo)[4]。既往研究表明，HO-1具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗廇性增生效應(yīng)，在缺血性心臟病發(fā)生發(fā)展的病理生理過程中發(fā)揮積極作用[5-6]。有研究利用HO-1基因轉(zhuǎn)染BMSCs后再移植，可以提高BMSCs在缺血性心肌病組織中的存活率[7]。另研究顯示利用腺病毒介導(dǎo)ADSCs過表達(dá)HO-1可以改善兔梗死心肌的心肌重構(gòu)和心臟功能[8]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒介導(dǎo)ADSCs過表達(dá)HO-1可以通過抑制經(jīng)典凋亡通路中凋亡效應(yīng)因子caspase-3 的活性對低氧無血清條件下的ADSCs起到保護作用[1]。本研究中我們通過CoPP誘導(dǎo)ADSCs內(nèi)源性HO-1高表達(dá)，結(jié)果顯示CoPP可明顯減少ADSCs在低氧無血清條件下的凋亡率，表明誘導(dǎo)內(nèi)源性HO-1的表達(dá)對低氧無血清環(huán)境下的ADSCs具有保護作用，與外源性提高HO-1的表達(dá)結(jié)果一致。本研究進一步重點探討了內(nèi)源性HO-1高表達(dá)是否可以通過除抑制經(jīng)典凋亡通路以外的其他分子機制提高ADSCs在低氧無血清環(huán)境中的存活率。

固有免疫系統(tǒng)是構(gòu)成機體抵御病原生物入侵的第一道防線。近年來越來越多的研究表明固有免疫的過度激活與多種疾病例如感染性疾病、缺血性疾病、2型糖尿病、動脈粥樣硬化、痛風(fēng)，關(guān)節(jié)炎等的發(fā)生密切相關(guān)。NLRP3作為模式識別受體家族中最重要的一個成員，包括由N端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)、半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domain，CARD)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding and oligomerization domain，NOD/NACHT)和C端的富含亮氨酸重復(fù)(leucine-rich repeat，LRR) 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。NLRP3能夠識別細(xì)胞內(nèi)的病原體以及細(xì)胞自身產(chǎn)生的危險信號，當(dāng)配體被C末端的LRR識別后，NLRP3通過NOD結(jié)構(gòu)域的寡聚作用發(fā)生構(gòu)象重排，引發(fā)效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的暴露，誘導(dǎo)具有相同CARD或PYD結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)分子ASC聚集至N端，ASC作為雙重接頭蛋白分子以橋梁形式將NLRP3與caspase-l連接起來，形成NLRP3炎性小體，剪接并激活caspase-l[9]。活化的caspase-1重要功能之一是將無活性的IL-1β前體裂解為具有活性的成熟的IL-1β分泌到胞外，產(chǎn)生無菌性炎性反應(yīng)[10]。活化的caspase-1的另一重要功能是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡(pyroptosis)[11]。焦亡細(xì)胞在形態(tài)上有部分凋亡特征，例如細(xì)胞核濃縮，染色質(zhì)DNA斷裂以及DAPI、TUNEL染色陽性，但細(xì)胞膜完整性會喪失，胞內(nèi)容物釋放。因此，NLRP3 炎性小體在產(chǎn)生和擴大無菌性炎性反應(yīng)的同時還直接通過激活caspase-1介導(dǎo)了自身細(xì)胞的死亡。本研究結(jié)果顯示低氧無血清下ADSCs細(xì)胞中NLRP3炎性小體各成員NLRP3、ASC 和活性caspase-1蛋白表達(dá)明顯升高，上清液中IL-1β水平顯著升高，表明NLRP3 炎癥小體激活是促進ADSCs在缺血微環(huán)境下死亡的機制之一。而CoPP可明顯抑制低氧無血清誘導(dǎo)的ADSCs中NLRP3、ASC 和活性caspase-1蛋白水平，并減少ADSCs上清液中IL-1β水平，表明提高HO-1的表達(dá)可通過抑制ADSCs中NLRP3 炎癥小體激活和IL-1β的分泌，對細(xì)胞產(chǎn)生保護作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，線粒體來源的ROS是調(diào)節(jié)NLRP3 炎性小體活化的關(guān)鍵信號，線粒體功能失調(diào)，以產(chǎn)生大量的ROS進而激活NLRP3，并且ROS 的抑制劑或清除劑能抑制NLRP3 炎癥小體的激活[12]。我們研究發(fā)現(xiàn)低氧無血清條件能明顯升高ADSCs細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。因此，我們推測細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的升高也參與了低氧無血清條件下ADSCs細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活。既往研究表明，HO-1具有抗炎、抗氧化的效應(yīng)。我們的實驗也證實CoPP可明顯抑制低氧無血清誘導(dǎo)的ADSCs細(xì)胞內(nèi)ROS水平，提示HO-1的高表達(dá)可能通過下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平抑制ADSCs細(xì)胞NLRP3 炎癥小體的激活。

[參 考 文 獻]

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