腎交感神經(jīng)去除術(shù)對(duì)心肌肥厚和心肌纖維化的影響*

王 強(qiáng)， 馬雙陶， 楊大春， 張 彥， 李 德， 唐 兵， 楊永健

(成都軍區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 成都 610083)

隨著人口老齡化和心血管疾病發(fā)病率逐年升高，心力衰竭已成為嚴(yán)重危害國人健康的重大公共問題。心肌重構(gòu)是心力衰竭的主要病理環(huán)節(jié)，心肌重構(gòu)主要包括：心肌肥厚(心肌細(xì)胞體積增大)和心肌纖維化(細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu))[1]。交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度活化在心肌重構(gòu)、心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用[2]，腎臟交感神經(jīng)是交感神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分；近期臨床研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)導(dǎo)管腎交感神經(jīng)消融術(shù)治療頑固性高血壓患者后，除了降低血壓外，還通過心臟超聲、心臟磁共振檢查觀察到心臟體積減小和心臟功能改善[3-4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，去除腎交感神經(jīng)不僅明顯降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓，還可以延緩其心肌肥厚的進(jìn)程[5]。然而，去除腎交感神經(jīng)除了通過降低血壓延緩心肌重構(gòu)外，是否可以直接抑制心肌重構(gòu)，目前尚不清楚。

本研究采用大鼠主動(dòng)脈縮窄(aortic constricted,AC)壓力超負(fù)荷模型，觀察腎交感神經(jīng)去除術(shù)(renal sympathetic denervation, RDN)對(duì)心肌肥厚和心肌纖維化的影響，并初步探討其可能機(jī)制，旨在為心力衰竭的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要材料

雄性SD大鼠60只，12周齡，體重約250 ～ 300 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，所有實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則；蘇木素、伊紅、苦味酸-天狼星紅染液購自上海優(yōu)選生物科技有限公司；去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)、腎素、血管緊張素II(angiotensin II, Ang II)放射免疫試劑盒購自Phoenix Pharmaceuticals。

2 動(dòng)物分組及干預(yù)

動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、sham+RDN組、AC組及AC+RDN組，主動(dòng)脈縮窄組按照以往的方法建立腹主動(dòng)脈縮窄壓力超負(fù)荷模型[6]。大鼠用戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰臥位消毒、鋪巾；行腹正中切口進(jìn)入腹腔，暴露分離后腹膜，在左腎動(dòng)脈上方游離腹主動(dòng)脈；沿游離的腹主動(dòng)脈長軸置入一折彎的大小為22 G(0.72 mm)的墊扎針，以3～0的絲線纏繞腹主動(dòng)脈后與墊扎針一起結(jié)扎，隨后立即抽出墊扎針，使腹主動(dòng)脈縮窄為1 mm的殘腔，而假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎。主動(dòng)脈縮窄大鼠及假手術(shù)大鼠按照劉潔等[7]的方法，分離雙側(cè)腎動(dòng)脈并通過苯酚包裹的方法去除腎交感神經(jīng)，分別為AC+RDN組和sham+RDN組。最后，所有大鼠局部給予青霉素預(yù)防感染，分層關(guān)閉腹腔。

3 主要方法

3.1大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、心臟功能測(cè)定 手術(shù)8周后進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和心臟功能的測(cè)定。參照以往的方法[8]，大鼠麻醉后，仰臥位消毒、鋪巾，分離右頸動(dòng)脈并插管，采用多導(dǎo)生理記錄儀(PowerLab，AD Instruments)記錄動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure, SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)和平均動(dòng)脈壓(mean artery pressure, MAP)，插管入左心室后記錄心室壓力曲線，根據(jù)Chart 5軟件計(jì)算左心室收縮期壓力(left ventricular end-systolic pressure, LVESP)、左心室舒張末期壓力(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、等容收縮期左室內(nèi)壓力上升最大速率(+dp/dt)和等容舒張期左室壓力下降最大速率(-dp/dt)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱量大鼠體重，抽取大鼠血液，處死大鼠，取出心臟，稱量心臟重量和左心室重量，計(jì)算左心室重量指數(shù)(left ventricular index)=左心室重量(mg)/體重(g)，將心臟標(biāo)本分別凍存于-80 ℃冰箱和置于甲醛中固定。

3.2心肌組織病理檢測(cè) 各組心肌組織經(jīng)甲醛固定后，常規(guī)石蠟切片，行HE染色和苦味酸-天狼星紅染色。用顯微鏡圖像分析軟件Image-Pro Plus測(cè)量心肌細(xì)胞大小和心肌纖維化面積，計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction, CVF)，CVF=膠原面積/總面積，計(jì)算方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行[9]。每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，取平均值。

3.3放射免疫實(shí)驗(yàn) 取100 mg左心室組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗后置于勻漿器中，加入1 mL生理鹽水在冰浴中進(jìn)行組織勻漿，勻漿液離心(3 000 r/min, 5 min)，取上清液。根據(jù)試劑盒說明書，放射免疫分析法測(cè)量血漿去甲腎上腺素、腎素活性(plasma renin activity, PRA)、血管緊張素II濃度以及心臟勻漿液中Ang II濃度，計(jì)算心臟Ang II含量(ng/g)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，使用SPSS 13.0軟件分析，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RDN對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)、心功能的影響

主動(dòng)脈縮窄8周后，大鼠SBP、DBP和MAP均顯著升高(P<0.01)，見表1，RDN不能降低主動(dòng)脈縮窄大鼠的血壓(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，主動(dòng)脈縮窄組出現(xiàn)明顯左室舒張功能受損[ (15.77±2.14) mmHgvs(2.64±0.42) mmHg；-dp/dt: (6 353±475) mmHg/svs(9 472±668) mmHg/s；P<0.01]。而RDN減輕主動(dòng)脈縮窄導(dǎo)致的左室舒張功能損害[LVEDP：(8.03±1.66) mmHgvs(15.77±2.14) mmHg；-dp/dt: (7 793±587) mmHg/svs(6 353±475) mmHg/s;P<0.01],見表1。

表1 RDN對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)和心功能的影響

2 RDN對(duì)心肌肥厚的影響

主動(dòng)脈縮窄8周后，大鼠左心室出現(xiàn)明顯的心肌肥厚[左心室重量指數(shù)：4.244±0.102vs2.415± 0.033;心肌細(xì)胞面積：(401.6±33.2) μm2vs(267.0±14.1) μm2；P<0.01];與主動(dòng)脈縮窄組相比，RDN組左心室心肌肥厚情況顯著改善[左心室重量指數(shù)：3.340±0.121vs4.244±0.102;心肌細(xì)胞面積：(332.9±28.9) μm2vs(401.6±33.2) μm2;P<0.01]，見圖1，提示RDN可以減輕主動(dòng)脈縮窄所導(dǎo)致的心肌肥厚。

Figure 1. Effect of RDN on cardiac hypertrophy in the rats (HE staining. The scale bar = 20 μm).Mean±SD.n=15.**P<0.01 vs sham; ##P<0.01 vs AC.

3 RDN對(duì)心肌纖維化的影響

心臟后負(fù)荷長期過重可導(dǎo)致心肌基質(zhì)膠原纖維增生，主動(dòng)脈縮窄組CVF較假手術(shù)組顯著增加(12.48%±1.82%vs1.95%±0.35%,P<0.01);與主動(dòng)脈縮窄組相比，RDN組的CVF明顯減少(7.76%±0.85%vs12.48%±1.82%,P<0.01)，見圖2，提示RDN可以減輕主動(dòng)脈縮窄所導(dǎo)致的心肌纖維化。

4 RDN對(duì)交感和RAS活性的影響

主動(dòng)脈縮窄8周后，大鼠血漿NE、PRA、Ang II濃度及Ang II含量均顯著增加(P<0.01)。與主動(dòng)脈縮窄組比較，RDN組的血漿NE濃度、PRA、Ang II濃度及心臟Ang II含量均明顯減少(P<0.01)，見圖3，提示RDN抑制腎臟交感活性后，可進(jìn)一步降低全身的交感、RAS系統(tǒng)活性和心臟局部的RAS活性。

Figure 2. Effect of RDN on cardiac fibrosis in the rats. The scale bar=100 μm.Mean±SD.n=15.**P<0.01 vs sham; ##P<0.01 vs AC.

討 論

在我國，高血壓和冠心病是心力衰竭的主要病因[10]。心肌重構(gòu)是心力衰竭的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，主要表現(xiàn)為心肌肥厚和心肌纖維化[1]。持續(xù)性的血壓升高可引起心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化，早期出現(xiàn)左室肥厚和舒張功能降低，逐步發(fā)展成為心臟收縮功能減退最終發(fā)生心力衰竭[11]。腎臟交感神經(jīng)的過度活化在高血壓、心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[2]。經(jīng)導(dǎo)管腎交感神經(jīng)消融術(shù)是一種新興的介入技術(shù)，通過導(dǎo)管從股動(dòng)脈進(jìn)入雙側(cè)腎動(dòng)脈，利用射頻消融電極的能量穿透血管壁破壞附著于血管外膜的腎臟傳入和傳出交感神經(jīng)纖維，達(dá)到腎臟去交感神經(jīng)支配的目的，具有手術(shù)時(shí)間短、手術(shù)位點(diǎn)局限創(chuàng)傷小、術(shù)后恢復(fù)時(shí)間短和并發(fā)癥少等特點(diǎn)，有望用于頑固性高血壓的治療[12]。研究表明，腎交感神經(jīng)消融術(shù)除降低頑固性高血壓患者的血壓外，還可使其心臟體積縮小，并改善患者的心臟功能[3-4]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠去除腎交感神經(jīng)后，其心肌重構(gòu)過程被明顯抑制[5]。然而，腎交感神經(jīng)消融術(shù)除通過降低血壓延緩心肌重構(gòu)外，能否直接抑制心肌重構(gòu)，目前尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)脈縮窄大鼠經(jīng)過RDN術(shù)后并未出現(xiàn)明顯的血壓下降，盡管前期大量研究證實(shí)RDN可用于治療頑固性原發(fā)性高血壓[12]，但本研究中的模型為縮窄主動(dòng)脈所致的繼發(fā)性高血壓，RDN并不能降低該模型的血壓。RDN可以明顯改善其左室舒張功能，病理實(shí)驗(yàn)顯示，RDN可以抑制主動(dòng)脈縮窄導(dǎo)致的心肌肥厚纖維化；說明RDN可以直接抑制心肌肥厚和纖維化、改善心臟舒張功能，而不依賴于其降低血壓所帶來的效果。交感系統(tǒng)、RAS系統(tǒng)和心臟局部RAS系統(tǒng)相互作用在主動(dòng)脈縮窄致心肌肥厚過程中發(fā)揮了重要作用[13-14]，本研究中，RDN在降低腎臟的交感活性后，進(jìn)一步使血清NE濃度、PRA、Ang II濃度和心臟Ang II含量明顯減少，說明RDN除降低交感和RAS活性外，還可降低心臟局部RAS活性，從而直接抑制心肌肥厚和心肌纖維化，改善心臟功能。腎臟交感神經(jīng)分為傳入神經(jīng)和傳出神經(jīng)，傳入神經(jīng)不能再生；然而腎移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)，傳出神經(jīng)可以在數(shù)月或十幾月內(nèi)再生[15]。因此，RDN對(duì)于心肌肥厚和心肌纖維化的遠(yuǎn)期防治效果有待進(jìn)一步研究。

Figure 3. Effect of RDN on sympathomimetic and renin-angiotensin system activity.mean±SD.n=15.**P<0.01 vs sham;##P<0.01 vs AC.

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] van Berlo JH, Maillet M, Molkentin JD. Signaling effectors underlying pathologic growth and remodeling of the heart[J]. J Clin Invest, 2013, 123(1): 37-45.

[2] Parati G, Esler M. The human sympathetic nervous system: its relevance in hypertension and heart failure[J]. Eur Heart J, 2012, 33(9):1058-1066.

[3] Brandt MC, Mahfoud F, Reda S, et al. Renal sympathetic denervation reduces left ventricular hypertrophy and improves cardiac function in patients with resistant hypertension[J]. J Am Coll Cardiol, 2012, 59(10):901-909.

[4] Mahfoud F, Urban D, Teller D, et al. Effect of renal denervation on left ventricular mass and function in patients with resistant hypertension: data from a multi-centre cardiovascular magnetic resonance imaging trial[J]. Eur Heart J, 2014, 35(33):2224-22316.

[5] 譚麗華, 李小剛, 郭運(yùn)忠, 等. 去腎交感神經(jīng)術(shù)對(duì)高血壓大鼠左室肥厚及其炎癥因子的影響[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2013, 42(5):550-555.

[6] Yang D, Ma S, Tan Y, et al. Adrenergic receptor blockade-induced regression of pressure-overload cardiac hypertrophy is associated with inhibition of the calcineurin/NFAT3/GATA4 pathway[J]. Mol Med Rep, 2010, 3(3):497-501.

[7] 劉 潔, 周音頻, 王 霄, 等. 去腎神經(jīng)對(duì)中年自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 34(4):336-340.

[8] 楊大春, 馬雙陶, 楊永健, 等. 激活PPARδ對(duì)梗死心肌MMP-9及纖連蛋白表達(dá)的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(11):2130- 2135.

[9] 馬雙陶, 楊大春, 唐 兵, 等. 白藜蘆醇抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抗酒精性心肌纖維化[J]. 中國動(dòng)脈硬化雜志, 2012, 20(1):21-24.

[10] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì), 中華心血管病雜志編輯委員會(huì). 中國心力衰竭診斷和治療指南2014[J]. 中華心血管病雜志, 2014, 42(2):98-122.

[11] Drazner MH. The progression of hypertensive heart disease[J]. Circulation, 2011, 123(3):327-334.

[12] Krum H, Schlaich M, Whitbourn R, et al. Catheter-based renal sympathetic denervation for resistant hypertension: a multicentre safety and proof-of-principle cohort study[J]. Lancet, 2009, 373(9671):1275-1281.

[13] Rathore HA, Munavvar AS, Abdullah NA, et al. Interaction between renin-angiotensin and sympathetic nervous systems in a rat model of pressure overload cardiac hypertrophy[J]. Auton Autacoid Pharmacol, 2009, 29(4): 171-180.

[14] Kumar R, Singh VP, Baker KM. The intracellular renin-angiotensin system: implications in cardiovascular remodeling[J]. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2008, 17(2):168-173.

[15] Grisk O, Gr?ne HJ, Rose HJ, et al. Sympathetic reinnervation of rat kidney grafts[J]. Transplantation, 2001, 72(6):1153-1155.