PYNOD對(duì)LPS活化的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響*

曾 琪， 戚仁斌， 胡巢鳳， 陸大祥△

(1贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000； 2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，廣東 廣州 510632)

小膠質(zhì)細(xì)胞廣泛分布在大腦和脊髓中。中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病過(guò)程中的免疫異常主要表現(xiàn)為小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，特定腦區(qū)炎癥因子水平升高[1]。在許多神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中，如帕金森病(Parkinson disease, PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)及多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis, MS)等，都出現(xiàn)了小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化和增殖，這是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要表現(xiàn)。

文獻(xiàn)報(bào)道，小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化不斷釋放一氧化氮(nitric oxide, NO)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NO synthase, iNOS)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、caspase-1以及其它促炎因子是導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡的原因[2-4]。這些炎癥因子對(duì)神經(jīng)元可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的毒性作用，最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死。因此抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化是目前防治神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)重要策略。

近年來(lái)，Wang等[5]發(fā)現(xiàn)一種新型的在體外具有抗炎活性的NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs)家族成員PYNOD。它由PYD結(jié)構(gòu)域和NOD結(jié)構(gòu)域組成，與該家族的其它成員不同，PYNOD的C末端缺乏作為配體識(shí)別區(qū)域的富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeats，LRRs)，也稱(chēng)NOD8[6-7]、 NLRP10、NALP10、CLR11.1或PAN5[5，8]。通過(guò)對(duì)PYNOD和炎癥相關(guān)因子構(gòu)建重組質(zhì)粒，研究其相互間的作用發(fā)現(xiàn)，PYNOD有抑制由caspase-1介導(dǎo)的IL-1β分泌的作用，這是NLRs家族中首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的對(duì)炎癥起負(fù)調(diào)節(jié)作用的成員。但PYNOD在神經(jīng)炎癥中所發(fā)揮的作用尚不清楚。本研究觀察PYNOD在LPS激活的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中的抗炎作用。

材 料 和 方 法

1 材料

BV2細(xì)胞和質(zhì)粒pEGFP-C2由本室保存；pEGFP-C2-PYNOD重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建；大腸桿菌E.coliDH5α購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染所用的陽(yáng)離子聚合物JetPeiTM為Polyplus產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM和胎牛血清為Gibco產(chǎn)品；胰蛋白酶購(gòu)自Hyclone；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa；二甲基亞砜(DMSO)和LPS為Sigma產(chǎn)品；中分子蛋白Marker為Fermentas產(chǎn)品；Griess試劑盒購(gòu)自Promega；所有抗體均購(gòu)自CST；小鼠IL-1β ELISA試劑盒購(gòu)自R&D；BCA法蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海申能博彩公司；硝酸纖維素膜為Millipore產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將BV2細(xì)胞以1×104/well 鋪于96孔板，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，并設(shè)與實(shí)驗(yàn)平行的本底對(duì)照孔。細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)78%～80%后轉(zhuǎn)染PYNOD重組質(zhì)粒，孵育24 h，每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，棄孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO振蕩10 min，待藍(lán)色顆粒完全溶解后，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上檢測(cè)570 nm處的吸光度(A)，以此定量反映細(xì)胞的活力。細(xì)胞活力=(加藥組A值-不加細(xì)胞組A值)/(對(duì)照組A值-不加細(xì)胞組A值)×100%。

2.2分組和給藥 用含10% 的胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)BV2細(xì)胞，0.25%胰酶消化BV2細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，以6×104/well 密度接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，實(shí)驗(yàn)分組如下：正常對(duì)照組(negtive control)；脂多糖組(LPS, 1 mg/L)； PYNOD低量轉(zhuǎn)染組：0.1 μg PYNOD轉(zhuǎn)染24 h后，給予1 mg/L LPS刺激； PYNOD中量轉(zhuǎn)染組：0.5 μg PYNOD轉(zhuǎn)染24 h后，給予1 mg/L LPS刺激； PYNOD高量轉(zhuǎn)染組：1.0 μg PYNOD轉(zhuǎn)染24 h后，給予1 mg/L LPS刺激。

2.3Griess法測(cè)定NO含量 根據(jù)NO溶解于水后可以形成亞硝酸鹽的原理，測(cè)定培養(yǎng)基中亞硝酸鹽(NO2-)的含量，可以間接反應(yīng)細(xì)胞上清中NO的含量。將BV2細(xì)胞以6×104/well 密度接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，貼壁過(guò)夜后，轉(zhuǎn)染處理。LPS 刺激24 h 后對(duì)NO2-進(jìn)行濃度的測(cè)定。具體操作步驟如下，實(shí)驗(yàn)前將試劑A、 B從4 ℃冰箱中取出，放置在室溫平衡30 min。亞硝酸鹽(nitrite)標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋(100、50、25、12.5、6.25、3.12和1.56 μmol/L)，用來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品以及待測(cè)樣本細(xì)胞上清液(均設(shè)3個(gè)復(fù)孔)各50 μL，加入 96孔板中，然后加入A溶液50 μL，室溫避光孵育10 min，再加入B溶液50 μL，室溫避光孵育10 min后，于30 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算上清液中NO2-含量。

2.4Real-time PCR檢測(cè) iNOS和IL-1βmRNA的表達(dá) 參照GenBank上小鼠iNOS和IL-1β基因的公布序列，用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0對(duì)其進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)上、下游引物，同時(shí)以擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)參照，由上海英駿生物公司合成。具體的引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

按實(shí)驗(yàn)分組培養(yǎng)細(xì)胞，37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞提取RNA并鑒定純度；按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄RNA。Real-time PCR反應(yīng)體系如下：cDNA 1 μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、引物(10 mol/L)各 0.4 μL，加RNase-Free H2O 至20 μL混勻。反應(yīng)條件為：95 ℃10 s； 95 ℃30 s，62 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán)；于每個(gè)循環(huán)的72 ℃ 10 s末收集1次熒光信號(hào)，循環(huán)結(jié)束后執(zhí)行收集熔解曲線(xiàn)程序。各梯度濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3 個(gè)平行管，反應(yīng)完畢后用熒光定量分析軟件進(jìn)行自動(dòng)繪制擴(kuò)增曲線(xiàn)以及熔解曲線(xiàn)，通過(guò)對(duì)熔解曲線(xiàn)的分析來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物特異性。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后，可對(duì)各受試樣本的相對(duì)定量值進(jìn)行檢測(cè)。

2.5Western blotting 檢測(cè)iNOS的蛋白水平 按實(shí)驗(yàn)分組培養(yǎng)細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)， LPS刺激24 h后提取細(xì)胞總蛋白，操作步驟見(jiàn)下：棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS 清洗3 次，每孔加 200 μL 細(xì)胞裂解液，冰上裂解 30 min，800 r/min，4 ℃離心5 min， 取上清， BCA 法蛋白定量。10% SDS- PAGE 分離蛋白， 半干法轉(zhuǎn)至 PVDF 膜。室溫下用封閉液封閉 2 h 后分別加入iNOS(1∶1000)和 GAPDH(1∶1000)抗體， 4 ℃孵育過(guò)夜。次日用TBST 洗膜3 次，每次10 min。將PVDF膜放于按1∶5000用TBST稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠II抗，室溫緩慢振蕩1 h 后，TBST 洗膜3 次，每次10 min。 將Western blotting 化學(xué)熒光試劑A、B 各300 μL 等量混合后，沖洗PVDF膜5 min后，于暗房中X 光片曝光，掃描儀掃描Western blotting圖像，Gel-pro Analyzer 4.5軟件分析Western blotting條帶的灰度。

2.6ELISA法測(cè)定BV2細(xì)胞中IL-1β的含量 按上述分組培養(yǎng)細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h；取出96孔培養(yǎng)板，4 ℃離心，200×g離心15 min，將每孔上清移至200 μL 滅菌離心管中，置-80 ℃保存?zhèn)溆?。試劑盒從冰箱中取出后置室溫下?fù)溫，雙蒸水稀釋濃縮的洗滌液(1∶20)。將標(biāo)準(zhǔn)品成比稀釋為所需的濃度。在使用前的30 min，按1∶100比列將試劑盒中提供的濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物分別稀釋為生物素化抗體工作液和酶結(jié)合物工作液，使用前30 min準(zhǔn)備。將細(xì)胞上清液樣本提前從-80 ℃冰箱中取出放置于4 ℃冰箱中，臨用平衡于室溫。實(shí)驗(yàn)具體步驟參見(jiàn)R&D ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)。計(jì)算每一種樣品3個(gè)復(fù)孔A值的平均值，將該值代入上述由標(biāo)準(zhǔn)品得到的直線(xiàn)回歸方程中，計(jì)算出細(xì)胞培養(yǎng)上清液中樣品的含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有結(jié)果以SPSS 11.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，數(shù)據(jù)比均采用單因素方差分析, 以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C2-PYNOD對(duì)BV2細(xì)胞活力的影響

如圖1，結(jié)果提示 0.1～1 ng重組質(zhì)粒pEGFP-C2-PYNOD作用BV2小膠質(zhì)細(xì)胞 24 h 后，不影響小膠質(zhì)細(xì)胞活力，與空白對(duì)照組相比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Figure 1. The effect of pEGFP-C2-PYNOD on the activity of BV2 cells. Mean±SD. n=3.

2 PYNOD抑制LPS激活的BV2細(xì)胞釋放NO

活化的小膠質(zhì)細(xì)胞能釋放NO參與神經(jīng)炎性損傷，為了分析PYNOD抑制NO釋放的作用，采用Griess試劑間接檢測(cè)細(xì)胞上清中NO。結(jié)果見(jiàn)圖2，單獨(dú)轉(zhuǎn)染pEGFP-C2和pEGFP-C2-PYNOD質(zhì)粒組有少量NO釋放，單純給予LPS刺激組的細(xì)胞釋放的NO量顯著升高，轉(zhuǎn)染不同量pEGFP-C2-PYNOD 的質(zhì)粒組中，NO的釋放呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)；其中0.5 μg和1.0 μg的pEGFP-C2-PYNOD轉(zhuǎn)染組NO的釋放量分別降至27 μmol/L和15 μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果提示PYNOD對(duì)LPS激活的BV2細(xì)胞釋放NO有顯著抑制作用。

Figure 2. Inhibitory effect of PYNOD on the release of NO in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs LPS alone.

3 PYNOD下調(diào)LPS 誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS的 mRNA 表達(dá)

由圖 3可見(jiàn)，空質(zhì)粒組及PYNOD單獨(dú)處理組與 LPS 組相比較，iNOS的 mRNA 幾乎沒(méi)有表達(dá)。而各PYNOD轉(zhuǎn)染組不同程度地降低了LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS mRNA 表達(dá)，呈現(xiàn)一定劑量依賴(lài)效應(yīng)。0.1 μg PYNOD轉(zhuǎn)染組iNOS mRNA的表達(dá)量與LPS 組相比較無(wú)顯著差異,而0.5 μg和1.0 μg PYNOD轉(zhuǎn)染組iNOS mRNA 表達(dá)量分別為L(zhǎng)PS 組的(52.5±2.5)%和(34.3±3.2)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果提示PYNOD能在 mRNA 水平抑制LPS 誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)。

Figure 3. Down-regulation effect of PYNOD on the expression of iNOS mRNA in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs LPS alone.

4 PYNOD對(duì)LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)IL-1β mRNA的影響

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法觀察PYNOD對(duì)IL-1β 轉(zhuǎn)錄水平的影響，正常組及PYNOD單獨(dú)處理組與LPS 組相比較，IL-1β 的mRNA 有少量表達(dá)，分為L(zhǎng)PS 組的(10.5±2.1)% 和(8.3±3.4 )% ，0.1 μg PYNOD轉(zhuǎn)染組IL-1β mRNA表達(dá)量與LPS 組相比較無(wú)顯著差異,而0.5和1.0 μg各PYNOD轉(zhuǎn)染組對(duì)LPS 誘導(dǎo)BV2細(xì)胞IL-1β mRNA 生成，出現(xiàn)明顯的抑制作用，表達(dá)量與 LPS 組相比較，分別為其表達(dá)量的(55.9±6.1)% 和(38.7±4.0)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)果提示PYNOD可在mRNA 水平抑制LPS 激活BV2細(xì)胞表達(dá)IL-1β，見(jiàn)圖4。

5 PYNOD下調(diào)LPS激活的BV2細(xì)胞iNOS蛋白的表達(dá)

iNOS 是合成NO 的關(guān)鍵酶，其蛋白表達(dá)量與炎癥介質(zhì)NO 的生成呈正相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)采用Western blotting觀察PYNOD對(duì)LPS激活的BV2細(xì)胞iNOS 蛋白表達(dá)的影響。單純LPS刺激組，經(jīng) LPS 刺激后24 h，iNOS 的表達(dá)顯著升高，而經(jīng) 0.1～1.0 μg PYNOD轉(zhuǎn)染組的BV2細(xì)胞，LPS 誘導(dǎo)的iNOS 表達(dá)量明顯降低，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)的下降，該結(jié)果提示PYNOD在蛋白水平可顯著抑制LPS激活的BV2細(xì)胞表達(dá)iNOS，見(jiàn)圖5。

Figure 4. The inhibitory effect of PYNOD on the expression of IL-1β in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs LPS alone.

Figure 5. PYNOD suppressed the production of iNOS protein in LPS-induced BV2 cells.

6 PYNOD下調(diào)LPS激活的BV2細(xì)胞IL-1β蛋白的表達(dá)

單純LPS刺激BV2細(xì)胞24 h 后，IL-1β濃度可達(dá)到551.5 ng/L，空白對(duì)照組為48.2 ng/L，各PYNOD轉(zhuǎn)染組均對(duì)IL-1β的分泌起到了不同程度的降低作用，呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)效應(yīng)。其中0.1、0.5 μg和1.0 μg PYNOD轉(zhuǎn)染組IL-1β的濃度分別降至442.0 ng/L、340.6 ng/L和250.3 ng/L，與LPS單獨(dú)處理組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。以上結(jié)果提示PYNOD可下調(diào)LPS 激活的BV2細(xì)胞IL-1β蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖6。

Figure 6. PYNOD decreased the release of IL-1β in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs LPS alone.

討 論

腦內(nèi)活化小膠質(zhì)細(xì)胞是引發(fā)神經(jīng)炎癥的重要發(fā)病機(jī)制之一。作為腦內(nèi)最主要的免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞游走于整個(gè)腦組織中，發(fā)揮著免疫防御的功能，確保腦組織能夠正常的行使生理功能，當(dāng)Aβ蛋白、LPS或IFN-γ等刺激小膠質(zhì)細(xì)胞后[9-10]，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)分泌一系列的炎癥介質(zhì)(其中包括NO、IL-1β、TNF-α、PGE2、活性氧、IL-6等)和神經(jīng)毒性物質(zhì)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[11-12]。近年來(lái)，隨著研究的不斷深入，通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化來(lái)緩解神經(jīng)炎癥，成為研究者所關(guān)注的焦點(diǎn)。

NO 的合成由3種同工酶催化：iNOS、神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS，eNOS)。由nNOS和eNOS產(chǎn)生的NO只能持續(xù)作用幾分鐘，而由細(xì)胞因子及內(nèi)毒素等誘導(dǎo)產(chǎn)生的iNOS催化生成的NO能夠持續(xù)作用數(shù)小時(shí)[13]。目前研究認(rèn)為在病理情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度表達(dá)iNOS合成大量的毒性氧自由基NO，它是造成神經(jīng)元損傷的重要原因[14-15]。IL-1β是IL-1的主要分泌形式[16-17]，是一種調(diào)節(jié)蛋白，在炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。其中小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是IL-1β最主要的來(lái)源[18]。神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病如AD、PD和MS等，它們的發(fā)病機(jī)制都與IL-1β的上調(diào)密切相關(guān)[19-20]。

本實(shí)驗(yàn)選取LPS活化BV2小膠質(zhì)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究PYNOD對(duì)LPS活化的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥產(chǎn)物的影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染PYNOD 0.5 μg和1.0 μg后，可以抑制LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子NO的釋放，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)PYNOD可抑制iNOS和IL-1β 的mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)PYNOD可下調(diào)iNOS蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染0.5～1.0 μg PYNOD重組質(zhì)粒對(duì)iNOS mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用呈一定劑量依賴(lài)關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)上調(diào)BV2細(xì)胞中PYNOD的表達(dá)，可通過(guò)抑制iNOS 的mRNA和蛋白表達(dá)呈劑量依賴(lài)方式減輕LPS誘導(dǎo)的NO的生成。PYNOD還可抑制促炎癥因子IL-1β在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)。此外，本實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染進(jìn)入BV2細(xì)胞的PYNOD在發(fā)揮減輕炎癥反應(yīng)的同時(shí)對(duì)細(xì)胞本身無(wú)明顯的毒性作用。以上結(jié)果表明PYNOD有可能在伴有小膠質(zhì)細(xì)胞活化的神經(jīng)變性疾病的治療中發(fā)揮重要作用，具有重要的潛在價(jià)值。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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