轉(zhuǎn)錄因子Hand2在妊娠期糖尿病胎鼠心臟發(fā)育過程中的表達(dá)

吳 瑕， 黃婉儀， 韓莎莎， 孫鳳杰， 徐 婧， 楊雪松， 柳國勝△

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院新生兒科， 2醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系，廣東 廣州 510632)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)的發(fā)病率在迅速增加，全球GDM的發(fā)病率在3%～14%之間[1]。澳洲開展流行病學(xué)調(diào)查顯示亞裔婦女的發(fā)病率最高(11.5%)，是澳洲婦女發(fā)病率的3倍(3.7%)[2]。2006年中國18城市的調(diào)查表明，GDM的總體發(fā)病率為4.3%。GDM可致胎兒發(fā)育異常，尤其是胎兒心臟畸形發(fā)生率高且嚴(yán)重影響患兒的生存質(zhì)量。美國研究顯示GDM孕婦其胎兒患心血管畸形(尤其是流出道畸形以及心臟瓣膜發(fā)育異常)的幾率是正常妊娠的3～5倍[3]。

堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)蛋白是與各種類型的細(xì)胞核組織的發(fā)育和功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。Hand1和Hand2是bHLH蛋白家族中最重要的轉(zhuǎn)錄因子，尤其對心肌細(xì)胞的增殖和分化、心臟發(fā)育模式及形態(tài)發(fā)生和心臟收縮有著重要的調(diào)控作用，與先天性心臟病的發(fā)生關(guān)系密切[4]。學(xué)者通過鼠的基因敲除等手段發(fā)現(xiàn)，純合體(Hand2-/-)突變鼠可出現(xiàn)明顯的心肌缺陷，這些心肌缺陷主要表現(xiàn)為心管環(huán)化障礙、右心室缺失、主動脈弓消失等[5]。本研究旨在了解GDM 胎鼠心臟發(fā)育過程中Hand2表達(dá)的變化，為深入探討其在GDM胎鼠心臟發(fā)育異常中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 動物和材料

無交配史的清潔級雌性成年SD大鼠120只，體重(260±18) g，雄鼠60只，體重(301±14) g。采購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物許可證號為SCXK(粵)2010-0002。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma; Trizol 提取液購自Invitrogen；Hand2 抗體購自Santa Cruz； SABC試劑盒及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司； 蛋白樣品初步定量采用南京凱基生物發(fā)展有限公司提供的試劑盒(型號為KGPBCA)；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1動物分組與模型制備[6]將無交配史的清潔級成年SD大鼠雌雄分開喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，尾靜脈采血測定雌鼠空腹血糖，若血糖>7.1 mmol/L，予以剔除。本實驗未剔除任何雌鼠。然后按雌雄比例2∶1合籠，第2天早上取陰道分泌物涂片，見精子之日定為妊娠第0天(E0)。飼養(yǎng)過程中有6只雌鼠未受孕或意外死亡，共有114只雌鼠成功受孕，受孕后單獨飼養(yǎng)，隨機分配到以下4組。

空白對照組(blank control組，n=24)：不加任何干預(yù)，受孕后72 h尾靜脈采血測定血糖。

GDM組(n=30)：將查到精子的大鼠空腹8 h后，用現(xiàn)配的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.l mmol/L，pH 4.4)配制成2% STZ新鮮溶液，按40 mg/kg一次性單側(cè)腹腔(近胰腺部位)注射[7]，4 h后給予正常飲食，72 h后尾靜脈采血測定血糖。若母鼠血糖>8.12 mmol/L，可進(jìn)入下一階段實驗流程；若血糖<8.12 mmol/L，則按10～15 mg/kg補注STZ，直至血糖>8.12 mmol/L。

檸檬酸組(negative control組，n=30)：將查到精子的大鼠空腹8 h后，用等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.l mol/L，pH 4.4，現(xiàn)配)，一次性單側(cè)腹腔(近胰腺部位)注射，4 h后正常飲食，72 h后尾靜脈采血測定血糖。

胰島素干預(yù)組(insulin組，n=30)：按上述GDM組處理后血糖>8.12 mmol/L者，每天下午5～6時皮下注射中效胰島素(諾和銳30R)16～20 U·kg-1·d-1，根據(jù)血糖水平每天調(diào)整胰島素用量,使空腹血糖控制在4.8～7.0 mmol/L，直至解剖取胎當(dāng)天。

2.2標(biāo)本收集與樣本制備 給藥72 h 后每天檢測孕鼠血糖及體重，各組分別于孕12 d(embryotic day, E12)、E15和E19隨機剖宮，觀察孕鼠流產(chǎn)情況，檢查胎鼠的外部形態(tài) (包括活胎、死胎及吸收胎等) ，稱量胎鼠體重并取材。本實驗中胎鼠發(fā)育異常情況參考了毛東偉等[8]所做的定義：死胎是指子鼠發(fā)育成形后死于宮內(nèi)；吸收胎是指子鼠尚未發(fā)育成形即逐漸被母體所吸收，尚留有部分組織，可出現(xiàn)液化或壞死的胚胎。

2.3HE染色 采用4%多聚甲醛溶液固定各實驗組心臟組織，常規(guī)脫水及石蠟包埋，制備成3μm連續(xù)切片后行HE染色，光鏡下觀察各組胎鼠心臟組織的病理學(xué)改變。

2.4胎鼠心臟組織Hand2 mRNA的檢測 采實時用熒光定量PCR法，以β-actin為內(nèi)參照,檢測胎鼠心臟Hand2 mRNA表達(dá)。Trizol法提取胎鼠心臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取2 μL進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系為25 μL，Hand2正義鏈5’ -TCCTACAGTCCCGAGTACGCCA-3’，反義鏈5’- GGCACTTGAATGGTATTTGGAGA -3’;β-actin正義鏈5′- ACCACAGTCCATGCCATCAC -3′，反義鏈5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，利用2-ΔΔCT方法分析不同組間Hand2的表達(dá)水平。

2.5免疫組化檢測Hand2蛋白表達(dá) 常規(guī)石蠟包埋，制作6μm切片。采用免疫組織化學(xué)SABC法染色，DAB顯色，經(jīng)蘇木素復(fù)染后，鹽酸乙醇分化；脫水、透明，中性樹膠封片、光鏡下檢查。染色均設(shè)立以PBS代替Ⅰ抗的陰性對照組。每個時點每組隨機抽取5張不同切片，每張切片于光鏡下(×200)隨機選取5個視野，固定窗口面積，利用Q-win圖像分析系統(tǒng)，測定平均灰度值以表示陽性產(chǎn)物的強度。

2.6Western blotting 檢測Hand2蛋白表達(dá)水平 取胎鼠心臟組織約100 mg，冰上操作，加500 μL RIPA裂解液于勻漿器中反復(fù)碾碎并離心以提取總蛋白；依據(jù)試劑盒說明書對蛋白樣品初步定量，取10 μL蛋白溶液加樣品處理液煮沸5 min，SDS-PAGE 120 min轉(zhuǎn)至PVDF膜后，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h；洗膜后加I抗，室溫孵育4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min；加II抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次5 min；將化學(xué)熒光發(fā)光底物均勻地加到膜的表面，且反應(yīng)持續(xù)5 min；去除膜表面的殘液，置于曝光盒中曝光、顯影、定影；采用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間采用2檢驗和t檢驗，組內(nèi)差異采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組胎鼠心臟組織病理學(xué)變化

正常大鼠胚胎在E12時，心臟外型上已基本具備成體心臟的雛形，心臟房間孔已發(fā)育基本完全。室間隔肌部與心內(nèi)膜墊之間留有室間孔。E15時，室間孔消失，室間隔膜部形成，至此心室完全分隔為左右心室，同時心房壁上出現(xiàn)較少的短小肌小梁結(jié)構(gòu)，心室壁增厚，心肌小梁增多。E19時，心臟繼續(xù)逐漸增大，心房心室壁繼續(xù)逐漸增厚，心肌小梁逐漸增多、增粗，同一孕期心臟大小均一，未見心肌壁異常增厚，房室間隔病理性缺損、動脈圓錐干畸形等異常情況。高倍鏡下可見心肌細(xì)胞呈橢圓形，胞漿豐富。核大，形態(tài)規(guī)則，染色均勻?？梢娦募》屎窦笆议g隔缺損，心臟畸形發(fā)生率低，見圖1。

Figure 1. The changes of fetal cardiac tissues on E12, E15 and E19 in control group and GDM group (HE staining, × 25)．A: blank control group B: GDM group on E15 and E19. a: interventricular septum rupture; b: truncus arteriosus communis; c: ventricular septal defect; d: ventricular chamber dilatation; e: interventricular septum increased thickness; f: myocardial hypertrophy．

GDM組胎鼠心臟組織病理切片可見圓錐干發(fā)育畸形(根據(jù)文獻(xiàn)報道，圓錐干畸形包括法洛四聯(lián)癥、大動脈轉(zhuǎn)位、動脈單干、右室雙流出道等，本研究中僅發(fā)現(xiàn)動脈單干)、室間隔缺損及室間隔裂、心肌壁肥厚、心腔擴(kuò)大等。高倍鏡下可見GDM組E12胎鼠心肌細(xì)胞排列尚整齊，胞漿未見明顯溶解，胞核形態(tài)尚規(guī)則，但細(xì)胞核染色較其它3組深；E15胎鼠心肌細(xì)胞排列欠整齊，胞漿稍有溶解，胞核形態(tài)不規(guī)則，并出現(xiàn)核皺縮等表現(xiàn)；E19胎鼠心肌細(xì)胞排列較紊亂，胞漿溶解，成片的無結(jié)構(gòu)區(qū)，胞核形態(tài)不規(guī)則。其它3組心肌細(xì)胞呈橢圓形，胞漿豐富，細(xì)胞核較大，形態(tài)規(guī)則，染色均勻，見圖2。

Negative control大鼠胚胎心臟發(fā)育情況與blank control組相似，偶見心臟發(fā)育畸形的胎鼠，E19見2只心臟畸形胎鼠，主要表現(xiàn)為心肌肥厚及室間隔缺損。

Figure 2. The expression of Hand2 on E12, E15 and E19 in 4 groups (immunohistochemical staining; × 200). Compared with other groups on E12 and E15, the expression of Hand2 in GDM group deceased at the same time points．

Insulin組大鼠胚胎心臟發(fā)育情況與blank control組相似，E12、E15和E19均可見胎鼠心臟發(fā)育異常，但其發(fā)生率不高，與A組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。胎鼠心臟畸形主要表現(xiàn)為心肌肥厚、室間隔缺損及心腔擴(kuò)大等。

2 各組胎鼠心臟發(fā)育畸形的比較

GDM組與其它3組相比較，其心臟畸形發(fā)生率明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 胎鼠心臟畸形例數(shù)的比較

*P<0.05vsblank control group.

3 免疫組化檢測各組胎鼠心臟組織Hand2 蛋白的表達(dá)

免疫組化發(fā)現(xiàn)Hand2蛋白主要表達(dá)于心臟組織的細(xì)胞核中，呈棕黃色顆粒狀。E12時，Hand2主要表達(dá)在右心室及大動脈根部；E15時，Hand2蛋白表達(dá)增加，并主要表達(dá)于右心室區(qū)域、主動脈弓及右室流出道等；E19時，Hand2蛋白表達(dá)量顯著升高，在右心室、動脈囊和主動脈弓等均表達(dá)，在左心室有少量表達(dá)。negative control組及insulin組Hand2蛋白定位表達(dá)情況與blank control組基本一致。GDM組E12及E15時Hand2蛋白的表達(dá)較其它3組明顯下降，E19時Hand2在胎鼠心臟表達(dá)量與其它3組相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

利用Q-win圖像彩色分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像半定量分析，測定平均灰度值以表示陽性產(chǎn)物的強度?；叶戎翟O(shè)定時，把純黑色定義為0，白色定義為255，故灰度值越低，其陽性反應(yīng)產(chǎn)物的強度越強，即表明Hand2蛋白含量越高。統(tǒng)計結(jié)果顯示，與同組各孕齡的平均灰度值相比，E12的平均灰度值最高，即其所表達(dá)的Hand2蛋白含量最低，其后依次為E15、E19，3者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；E12時，GDM組平均灰度值高于其它3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而3組平均灰度值兩兩比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；E15的情況與E12相似，GDM組平均灰度均高于其它3組，且有統(tǒng)計學(xué)意義。但E19時，4組心臟組織的平均灰度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 免疫組織化學(xué)檢測Hand2蛋白表達(dá)情況

**P<0.01vstinsulin group．

4 各組胎鼠心臟組織中Hand2 mRNA的表達(dá)水平

Real-time qPCR分析結(jié)果顯示，E12及E15時，GDM組胚胎心臟組織中的Hand2表達(dá)與其它3組相比明顯降低，E19時Hand2 mRNA表達(dá)水平與其余3組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

Figure 3. Ralative mRNA expression of Hand2 in the myocardial tissues from each group measured by real-time fluorescence quantitative RT-PCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs blank control group．

5 各組胎鼠心臟組織中Hand2蛋白的表達(dá)水平

用Western blotting檢測各組胚胎心臟組織中Hand2蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示GDM組E12和E15時點的Hand2表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4、5。

討 論

GDM是指妊娠期間首次發(fā)現(xiàn)或發(fā)生的不同程度的糖耐量異常[9]，其發(fā)病率在世界范圍不斷上升[10]，對孕母和胎兒均有不良影響，是胚胎期發(fā)生心血管畸形的病因之一，有研究提示GDM孕婦胎兒發(fā)生心血管畸形的風(fēng)險是正常孕婦的5倍[11]。糖尿病誘導(dǎo)胚胎畸形的確切機制還不明確，高血糖被認(rèn)為是對心血管發(fā)育造成不利影響的主要原因；在高血糖環(huán)境下控制正常心臟神經(jīng)節(jié)發(fā)育的基因表達(dá)被改變，從而導(dǎo)致中斷心臟神經(jīng)節(jié)的分化[12]。高血糖可使孕婦體內(nèi)發(fā)生各種激素及氧化物代謝紊亂，胎兒發(fā)育所需的某些轉(zhuǎn)錄因子或關(guān)鍵基因等物質(zhì)在這樣的環(huán)境下發(fā)生質(zhì)或量的改變，最終導(dǎo)致胎兒先天畸形的發(fā)生。在本實驗中，我們觀察到GDM組液化吸收胎、死胎、畸形胎等發(fā)育異常胚胎的發(fā)生率明顯高于blank control組，GDM組胎鼠心臟發(fā)育異常與臨床資料中GDM孕母所致胎兒心臟發(fā)育異常的病理類型相符合[13]。同時，我們專門設(shè)計insulin組控制血糖在正常范圍內(nèi)，觀察STZ 藥物本身是否對胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響，結(jié)果insulin組的液化吸收胎的發(fā)生率升高，甚至與GDM組相近；而insulin組胎鼠表觀畸形與心臟發(fā)育畸形的比例卻遠(yuǎn)低于GDM組。這一現(xiàn)象引起了我們的猜測：鏈脲佐菌素藥物本身可能對大鼠早期胚胎發(fā)育有一定影響，但其對胚胎心臟等其它器官的發(fā)育影響不大。對于這一猜測的真實性，則仍需要我們進(jìn)一步探討。

Figure 4. The expression of Hand2 protein in embryonic heart tissue detected by Western blotting.

Figure 5. The expression of Hand 2 protein in the fetal rat cardiac tissues from each group measured by Western blotting. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs blank control group．

bHLH蛋白家族是心臟形成過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，它將上游誘導(dǎo)信號與下游調(diào)控基因聯(lián)系起來, 控制心肌細(xì)胞的增殖和分化、心臟發(fā)育模式及形態(tài)發(fā)生和心臟收縮[14]。Hand2是bHLH蛋白家族的重要成員，與胚胎心臟發(fā)育密切相關(guān)。在心管形成前, Hand蛋白首先在心臟前體側(cè)壁中胚層、神經(jīng)嵴和腮弓上表達(dá)，然后持續(xù)表達(dá)于整個心臟發(fā)育過程中，直到心腔分化完成。雖然在哺乳動物心臟形態(tài)形成和早期胚胎心管不對稱環(huán)化過程中Hand1 和Hand2 最初是共同表達(dá)的，但隨后Hand1 逐漸主要局限在左心室表達(dá)，Hand2 逐漸主要局限在右心室表達(dá)[15]。不少學(xué)者在雞胚和鼠胚的研究表明[16]，Hand2 在胚胎心臟、血管、肢體等發(fā)育過程中扮演重要角色。Liang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚中，Hand2不僅在胚胎發(fā)育早期的側(cè)板中胚層有較強表達(dá)，隨著胚胎發(fā)育時間的推移，還表達(dá)于胚胎的咽弓、心臟和鰭芽。本實驗結(jié)果顯示：GDM組及對照組胎鼠心臟中均可檢測到Hand2的表達(dá)，E12時Hand2主要表達(dá)在右心室及大動脈根部；E15時，Hand2蛋白的表達(dá)增加，并主要表達(dá)于右心室區(qū)域、主動脈弓及右室流出道等；E19時，Hand2蛋白的表達(dá)量顯著升高，在右心室、動脈囊和主動脈弓等均表達(dá)，表明Hand2在胚胎心臟發(fā)育過程中表達(dá)呈現(xiàn)上升過程。

孫淑娜等[18]向斑馬魚胚胎注射嗎啡啉修飾的反義寡核苷酸(morpholino oligonucleotides，MO)抑制Hand2基因的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)其胚胎心臟發(fā)育異常比例顯著升高。Morikawa等[19]指出Hand2基因在神經(jīng)嵴中的缺失可以導(dǎo)致流出道及主動脈弓動脈的對位不良，導(dǎo)致的心臟畸形表現(xiàn)為肺動脈及右鎖骨下動脈食管后位。GDM組胎鼠心臟畸形的發(fā)生率明顯高于其余3組，心臟畸形的種類包括室間隔缺損、圓錐干畸形、心肌肥厚以及心室腔擴(kuò)大等，與缺乏Hand2導(dǎo)致的心臟畸形種類基本相吻合。

Hand2通過多種信號通路以及與其它基因之間相互作用參與調(diào)節(jié)胚胎心臟的發(fā)育。在老鼠模型中，RRR109-111突變可撤除Hand2 DNA對于熒光素酶報導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)合和活化[20]，造成胎鼠10.5 d死亡和右心室發(fā)育異常，提示Hand2可通過依賴結(jié)合DNA和獨立的機制來調(diào)節(jié)體內(nèi)組織生長和發(fā)育[21]。Zhao等[22-23]發(fā)現(xiàn)某些microRNA可特異性結(jié)合Hand2 mRNA, 阻止其翻譯成蛋白質(zhì), 導(dǎo)致胚胎發(fā)育初期心肌前體細(xì)胞的擴(kuò)增受限, 進(jìn)而造成心室沒有足夠心肌細(xì)胞而發(fā)展為畸形，提示Hand2可通過microRNA在轉(zhuǎn)錄后翻譯水平調(diào)節(jié)蛋白合成，從而影響胚胎心臟發(fā)育。本實驗表明，E12、E15 GDM 模型鼠的Hand2 mRNA 及蛋白水平較對照組下降(P<0.05)，Hand2基因在妊娠期高血糖環(huán)境下發(fā)生突變，導(dǎo)致其mRNA及表達(dá)產(chǎn)物下調(diào)，從而影響了胚胎心臟的發(fā)育調(diào)控過程，導(dǎo)致先天性心臟缺陷。至于Hand2的表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致何種類型的心臟發(fā)育畸形，它又是通過何種具體途徑導(dǎo)致GDM母親胎兒心臟發(fā)育畸形，仍有待進(jìn)一步研究。

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