3種中成藥中西紅花苷-1和梔子苷的UPLC含量測(cè)定

國(guó)佳瑩，陳 陽(yáng)，鄧 亮，郝 順，蔡仕寧，王雅溶

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 藥劑學(xué)教研室,廣東 珠海 519041;2.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

婦科分清丸、黃連上清丸和芎菊上清片均含有梔子藥材。婦科分清丸由包括梔子、當(dāng)歸和川芎在內(nèi)的11味中藥組成，梔子占比8.9%。黃連上清丸由黃連和梔子等17味中藥組成，梔子占比6.1%。芎菊上清片由川芎、黃芩和梔子等15味中藥組成，梔子占比7.2%。2010版國(guó)家藥典對(duì)后兩種中成藥的品質(zhì)評(píng)價(jià)是分別采用HPLC測(cè)定藥品中的黃芩和黃連的有效成分[1-2]，而婦科分清丸則沒有含量測(cè)定項(xiàng)。藥典記載以上3種中成藥都屬于清熱藥，而梔子的主要功效就是瀉火除煩、清熱利濕，因此有必要對(duì)該三味中成藥中梔子進(jìn)行質(zhì)量控制。前期，本課題組對(duì)梔子有效成分梔子苷和西紅花苷有效成分進(jìn)行了深入研究[3-4]。本論文則采用UPLC來(lái)測(cè)定以上3種中成藥中梔子的主要成分梔子苷和西紅花苷-1的含量，結(jié)果顯示，方法操作簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可作為這幾類制劑測(cè)定梔子有效成分含量的方法。

1 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑 ACQUITY UPLC(美國(guó)waters公司，配有Waters Acquity UPLC BEH Shield RP C18(包2.1 μm x 50 mm)色譜柱，四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、Empower 3色譜工作站)，XS205 1/100000電子天平(METTLER TOLEDO儀器有限公司)。KQ3200超聲波清洗器。UPLC用乙腈為色譜純(Merck)，水為屈臣氏蒸餾水；其余試劑均為分析純。西紅花苷-1(crocin-1)的分離見作者前期發(fā)表文獻(xiàn)[5]，簡(jiǎn)述如下：梔子藥材(20 kg)粉碎成粗粉，加入40%乙醇滲漉(4×40 L)，滲漉液濃縮至無(wú)醇味，然后加水溶解，采用大孔吸附樹脂HPD-100分離，洗脫劑分別為水，25%乙醇和60%乙醇。25%部分重結(jié)晶獲得梔子苷2 g，60%乙醇部分濃縮得梔子黃，采用硅膠柱層析分離，洗脫劑為乙酸乙酯-(甲醇-水(16∶13))(5%, 10%, 15%, 20%)，20%部分得到西紅花苷-1 (3 g)。

婦科分清丸、黃連上清丸和芎菊上清片均為國(guó)內(nèi)廠家生產(chǎn)，購(gòu)于珠海源春林藥房。

1. 2 方法

1.2.1 供試品溶液和對(duì)照品溶液的制備 成藥分別研碎，精密稱定0.2 g，置10 mL容量瓶中，加入濃度為50%的乙醇溶液，超聲提取20 min，取出定容至刻度。振搖均勻，取液層離心(8 000 r·min-1，10 min)，上清液用0.2 μm的濾膜過濾后作為供試品溶液。精密稱取梔子苷適量，分別加甲醇配制成對(duì)照品溶液：1.5、 3.0、6.0、12.0、24.0 μg/mL的梔子苷對(duì)照品溶液。另精密稱取西紅花苷-1適量，分別加甲醇配制成對(duì)照品溶液：2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL的西紅花苷-1對(duì)照品溶液。

1.2.2 色譜條件 流動(dòng)相為水(A)一乙腈(B)梯度洗脫(0～5 min，90%A～82%A；5～13.3 min，82%A～62%A; 13.3～16.7 min，62%A～50%A; 16.7～19 min，50%A～90%A;)。流速為0.28 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：0～6 min: 238 nm, 6～18 min: 440 nm，進(jìn)樣量3 μL。

1.2.3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)、精密度實(shí)驗(yàn)和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別取成藥粉末3份，每份約1.0g，精密稱定。分別加入不同量的梔子苷和西紅花苷-1對(duì)照品溶液，加甲醇-水(50∶50)定容至50 mL，按“1.2.2”色譜條件測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率。按“1.2.2”色譜條件分別測(cè)定梔子苷和西紅花苷-1對(duì)照品溶液6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD。按“1.2.2”色譜條件分別于0.5、1、3、6、12、24 h測(cè)定梔子苷和西紅花苷-1，記錄峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.4 線性考察試驗(yàn) 取各濃度梔子苷和西紅花苷對(duì)照品按“1.2.3”色譜條件測(cè)定含量，數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

1.2.5 含量測(cè)定 供試品的含量測(cè)定在“1.2.2”項(xiàng)的色譜條件下，取“1.2.1”項(xiàng)的制備的供試品溶液分析，測(cè)定含量。

2 結(jié)果

2.1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)、精密度實(shí)驗(yàn)和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 梔子苷和紅花苷-1超高效液相色譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見圖1、圖2。加樣回收率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算，梔子苷回收率分別為99.1%、98.2%和98.9%，而西紅花苷-1回收率分別為97.6%、98.4%和98.5%，表明方法準(zhǔn)確。緊密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算，梔子苷對(duì)照品峰面積的RSD=1.55%，西紅花苷-1對(duì)照品峰面積的RSD=2.25%，表明儀器精密度良好。此外，穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD分別為1.49%和2.01%。表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 梔子苷超高效液相色譜圖

圖2 西紅花苷-1超高效液相色譜圖

2.2 線性考察試驗(yàn) 線性考察試驗(yàn)顯示，梔子苷在1.5～24.0 μg/mL線性關(guān)系良好，西紅花苷-1在2.5～40.0 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.3 含量測(cè)定實(shí)驗(yàn) 婦科分清丸、黃連上清丸和芎菊上清片的UPLC含量測(cè)定圖譜見圖3～5。經(jīng)計(jì)算，3種制劑中梔子苷含量分別是0.22%、0.19%和0.47%，而西紅花苷-1含量分別是0.014%、0.252%和0.56%。

圖3 婦科分清丸超高效液相色譜圖

圖4 黃連上清丸超高效液相色譜圖

圖5 芎菊上清片超高效液相色譜圖

3 討論

實(shí)驗(yàn)對(duì)比乙腈和甲醇分離效果，結(jié)果顯示，乙腈作為流動(dòng)相，色譜分離度和峰形均較好。由于梔子苷和西紅花苷-1極性均比較強(qiáng)，所以流動(dòng)相從10%乙腈開始洗脫，并逐漸增加乙腈比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50%乙腈能洗脫3個(gè)制劑中所有成分，并使兩個(gè)成分和樣品中其它成分獲得基線分離。同時(shí)，檢測(cè)波長(zhǎng)分別采用梔子苷和西紅花苷-1的最大吸收波長(zhǎng)，增加方法靈敏度，減小誤差。

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)含有梔子藥材的各種中藥復(fù)方一般都沒有梔子主要成分梔子苷和西紅花苷-1含量測(cè)定的規(guī)定，考慮到含梔子的中成藥大多屬于清熱藥，而梔子的主要功效就是瀉火除煩、清熱利濕。因此，對(duì)梔子中主要指標(biāo)成分的定性和定量在客觀上有一定的必要。因此，以上中成藥中梔子苷和西紅花苷含量的高低可能會(huì)對(duì)相應(yīng)中成藥的藥理療效存在一定影響。故本文在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，增加了以上3種中成藥中梔子苷和含量約為梔子藥材中總西紅花苷的87%的西紅花苷-1含量的測(cè)定，有利于更全面反映以上幾類中成藥的內(nèi)在品質(zhì)。

考慮到梔子化學(xué)成分對(duì)這一類含梔子中成藥藥理療效的發(fā)揮可能具有潛在的影響，本課題組最近對(duì)3個(gè)含梔子藥材的中成藥中西紅花苷-1進(jìn)行含量測(cè)定[6]。而本課題組前期采用的HPLC測(cè)定梔子藥材西紅花苷每次測(cè)定耗時(shí)60 min[7]，而本實(shí)驗(yàn)建立了20 min 內(nèi)快速鑒定并測(cè)定3種含梔子成藥中梔子苷和西紅花苷-1的方法。本方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，可用于以上3種中成藥中梔子苷和西紅花苷-1的含量測(cè)定方法。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版(一部) [M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：1066.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版(一部) [M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：676.

[3] 陳陽(yáng)，趙璨，張浩，等. 不同濃度乙醇提取梔子有效成分效果的研究 [J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，32 (5)：439-444.

[4] Chen Y,Cai L,Zhao C, et al. Spectroscopic, stability and radical-scavenging properties of a novel pigment from gardenia [J]. Food Chem,2008,109(2)：269-277.

[5] Chen Y,Zhang H,Tian X,et al. Antioxidant potential of crocins and ethanol extracts ofGardeniajasminoidesELLIS andCrocussativusL:A relationship investigation between antioxidant activity and crocin contents [J].Food Chem,2008,109 (3)：484-492.

[6] 陳陽(yáng)，張浩，蔡樂，等. UPLC測(cè)定3種中藥制劑中的西紅花苷-1 [J]. 華西藥學(xué)雜志, 2014,29(3)：321-322.

[7] Chen Y, Hao Z, Yi-Xin L, et al. Crocin and geniposide profiles and radical scavenging activity of gardenia fruits (GardeniajasminoidesEllis.) from different cultivars and during fruit maturation [J]. Fitoterapia, 2010, 81(4)：269-273.