牙周病患者牙結(jié)石中納米級(jí)礦化顆粒的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

王斯瑋，楊 嵐， 劉建國(guó)，顧 瑜 ，白朋元， 白國(guó)輝,3 ，田 源

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 口腔學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.貴州省高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099)

納米級(jí)礦化顆粒(Calcifyingnanoparticles,CNPs)，曾稱之為納米細(xì)菌(Nanobacteria),是芬蘭科學(xué)家Kanjander教授團(tuán)隊(duì)在20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的一種直徑20～500nm，具有自我復(fù)制能力、能產(chǎn)生堅(jiān)硬生物礦化外殼、參與病理性鈣化形成，且具有細(xì)胞毒性的新型物質(zhì)[1]。目前，由于缺乏可信的基因序列以及蛋白礦物質(zhì)復(fù)合物學(xué)說的提出使得CNPs作為新型細(xì)菌的觀點(diǎn)受到質(zhì)疑[2-4]。雖然對(duì)CNPs的爭(zhēng)論不斷，但其作為病理性鈣化病因?qū)W探究的一個(gè)新的切入點(diǎn)仍然具有重要研究意義。牙結(jié)石是病理性鈣化在口腔疾病中的表現(xiàn)形式之一，也是牙周病重要的局部促進(jìn)因素，其形成機(jī)制尚不清楚，CNPs的提出為牙結(jié)石的形成機(jī)理提供了新的方向。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同程度牙周病患者的齦上牙石、齦下結(jié)石進(jìn)行CNPs的分離培養(yǎng)，比較不同牙位、不同性別CNPs的培養(yǎng)率以及對(duì)培養(yǎng)陽性的樣本進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步觀察，為探討牙結(jié)石形成、牙周病病因?qū)W提供更多的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 以2013年3月至9月就診于遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院牙周科患者為研究對(duì)象,所有患者知情同意。記錄患者口腔牙周情況后分為牙齦炎組10例、輕度牙周炎組10例、中重度牙周炎組10例，分別采集病人下前牙舌面及上頜磨牙頰面的齦上牙石、齦下牙石作為實(shí)驗(yàn)樣本,其中牙齦炎組只采集齦上牙石,以上30例病例又根據(jù)性別再分為兩組進(jìn)行比較，所有樣本均符合國(guó)際牙周病診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]且均排除全身其他系統(tǒng)疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器、試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone 公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)，中性樹膠(Solarbio公司)，醫(yī)用凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)，CO2恒溫培養(yǎng)箱 (Themro公司)， 倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng) (Olympus)，日立H-7650型透射電鏡(日立公司)，HE染液，茜素紅鈣染液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CNPs的采集 分別采用齦上潔治器、齦下刮治器采集病人下前牙舌面及上頜第一磨牙頰面的齦上牙石、齦下牙石。其中牙齦炎組只采集以上兩個(gè)位點(diǎn)的齦上牙石，樣本分別裝入含有1mL生理鹽水的EP管中，冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃凍存，待統(tǒng)一處理。

1.3.2 CNPs的分離[6]樣本室溫下解凍，置于無菌研缽中機(jī)械碾碎，加入1 mL 1mol/L HCl混合均勻研磨10 min，靜止脫礦20 min，加入1 mL 1 mol/L NaOH中和，5倍體積生理鹽水稀釋，pH調(diào)節(jié)至7.4～7.8，14 000g、4 ℃離心45 min，棄大部分上清液，留離心管底部1mL液體及沉淀，加2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，通過0.45 μm及0.22 μm濾膜過濾后為CNPs分離液，另加2倍體積含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基經(jīng)0.22 μm過濾后入無菌試管，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組以無菌PBS代替CNPs分離液，其余成分相同。

1.3.3 CNPs的培養(yǎng) 從培養(yǎng)第1周開始記錄CNPs的生長(zhǎng)情況至第4周為臨界點(diǎn)，出現(xiàn)肉眼可見白色沉淀為培養(yǎng)陽性。繼續(xù)觀察第6、8、12周時(shí)的CNPs生長(zhǎng)狀態(tài)。培養(yǎng)過程中定期對(duì)標(biāo)本進(jìn)行地衣紅染色，排除支原體污染。

1.3.4 光鏡、HE染色及茜素紅鈣染色觀察 選擇培養(yǎng)物肉眼觀察陽性的標(biāo)本，14 000g、4 ℃離心20 min，棄上清，無菌PBS洗3次，滴于載玻片，自然干燥，95%乙醇固定20 min后烤干。光鏡觀察于樣本處理后直接中性樹膠封片；HE染色，蘇木素染2～3 min，自來水沖洗，伊紅染1 min，沖洗吹干后中性樹膠封片；茜素紅鈣染色，75%乙醇固定10 min，蒸餾水洗，茜素紅染液37 ℃10 min，干燥，中性樹膠封片。

1.3.5 透射電鏡觀察 肉眼觀察陽性標(biāo)本，14 000g、4 ℃離心20 min，棄上清，無菌PBS洗3次，再次離心棄上清后加入2.5%戊二醛固定2h，漂洗，1%鋨酸固定1 h，漂洗，塊染，梯度脫水，丙酮：包埋液=1∶4，37 ℃烘箱過夜，包埋聚合45 ℃3 h，透射電鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。不同程度牙周炎患者牙結(jié)石中CNPs分離培養(yǎng)陽性率比較采用R×C行列聯(lián)表Fisher確切概率法，其余組別分離培養(yǎng)率用2檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間多重比較，以檢驗(yàn)水準(zhǔn)以檢驗(yàn)水準(zhǔn)α1=0.016 7，P<0.016 7表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CNPs分離培養(yǎng) 培養(yǎng)至第4周時(shí)，同一樣本不同牙位、不同部位任意一組試管底部出現(xiàn)肉眼可見白色沉淀者為CNPs培養(yǎng)陽性(見圖1)，實(shí)驗(yàn)觀察白色沉淀與試管底部附著較為緊密，輕振蕩有少量沉淀懸浮，PBS對(duì)照組無沉淀物產(chǎn)生。分離培養(yǎng)率比較：牙齦炎組分離培養(yǎng)陽性率為10%，輕度牙周炎為70%，中重度牙周炎組為80% (P<0.01)，組與組之間進(jìn)行多重比較，中重度牙周炎組分離培養(yǎng)率明顯高于牙齦組(P<0.0167)而牙齦炎組與輕

度牙周炎組、輕度牙周炎組與中重度牙周炎組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.0167，見表1)；比較輕度牙周炎組與中重度牙周炎組樣本齦上牙石和齦下牙石CNPs的分離培養(yǎng)陽性率，齦下牙石為62.50%高于齦上牙石20.00%，(2=14.91，P<0.01，見表2)；下前牙組CNPs分離培養(yǎng)陽性率28.33%，上頜第一磨牙組為25%(2=0.17.P>0.05，見表3)；男、女分離培養(yǎng)陽性率分別為56.25%、50%(P>0.05，見表4)。繼續(xù)培養(yǎng)至第6、8、12周，CNPs持續(xù)增多。

圖1 CNPs培養(yǎng)4周試管底部出現(xiàn)白色沉淀物

表1不同程度牙周病患者牙結(jié)石CNPs分離培養(yǎng)率比較[n(%)]

分組例數(shù)牙周病患者牙結(jié)石CNPs分離培養(yǎng)(例數(shù))陽性陰性檢出率牙齦炎組輕度牙周炎組中重度牙周炎組10101017893210.00#70.0080.00 #

#表示組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.0167。

表2輕度牙周炎組與中重度牙周炎組齦上牙石和齦下牙石CNPs分離培養(yǎng)率比較[n(%)]

分組例數(shù)牙周病患者牙結(jié)石CNPs分離培養(yǎng)(例數(shù))陽性陰性檢出率齦上結(jié)石組4083220.00#齦下結(jié)石組40251562.50#

#表示組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.01。

表3不同牙位CNPs分離培養(yǎng)率比較[n(%)]

分組例數(shù)牙周病患者牙結(jié)石CNPs分離培養(yǎng)(例數(shù))陽性陰性檢出率男169756.25女147750.00

表4不同性別患者牙結(jié)石CNPs分離培養(yǎng)率比較[n(%)]

分組例數(shù)牙周病患者牙結(jié)石CNPs分離培養(yǎng)(例數(shù))陽性陰性檢出率下頜切牙組60174328.33上頜第一磨牙組60154525.00

2.2 光鏡及HE染色 光學(xué)顯微鏡下觀察4周時(shí)CNPs呈簇集狀小顆粒(見圖2A)，HE染色見小顆粒周圍染成深藍(lán)色(見圖2B)，茜素紅鈣染色見橘色圓形小顆粒(見圖2C)，PBS對(duì)照組呈陰性(見圖2D)。

2.3 透射電鏡 制超薄切片透射電鏡下觀察CNPs培養(yǎng)物呈圓形、卵圓形、短桿狀顆粒，周圍見一層高密度影(圖3A、B)。

A:CNPs光鏡;B:CNPs HE染色;C:CNPs茜素紅鈣染色;D:PBS對(duì)照組。圖2 牙周病患者牙結(jié)石CNPs培養(yǎng)顯微鏡觀察結(jié)果(×200)

A:CNPs 1.0μm TEM;B: CNPs 0.5μm TEM。圖3 牙周病患者牙結(jié)石CNPs培養(yǎng)透射電鏡觀察結(jié)果

3 討論

CNPs在腎結(jié)石、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤砂礫樣小體、髓石等諸多病理性鈣化疾病中均有檢出的報(bào)道,該物質(zhì)結(jié)構(gòu)微小、普通培養(yǎng)基難于存活、對(duì)高溫強(qiáng)酸等具有很強(qiáng)的抵抗力，它主要的兩大生物學(xué)特性是形成鈣化物質(zhì)和具有細(xì)胞毒性[7-9]。牙周炎是最常見的口腔慢性疾病之一，是導(dǎo)致成年人牙齒喪失的首位原因，牙結(jié)石作為牙周炎重要的局部促進(jìn)因素其形成機(jī)制尚不明確，CNPs獨(dú)特的生物學(xué)特性為牙結(jié)石形成原因的研究提供了新的方向。

本實(shí)驗(yàn)前期對(duì)CNPs培養(yǎng)方法進(jìn)行了探索，在Kajander團(tuán)隊(duì)腎結(jié)石CNPs分離培養(yǎng)方法[6]基礎(chǔ)上，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)條件做了適當(dāng)調(diào)整，培養(yǎng)率較前方法有所增加。本實(shí)驗(yàn)分別比較了不同程度牙周炎之間CNPs的分離培養(yǎng)情況，觀察到中重度牙周炎組分離出CNPs的概率較牙齦炎組高，推測(cè)在病情較輕的牙齦炎患者CNPs的含量少，在分離培養(yǎng)過程中容易受到破壞，而對(duì)于牙周炎病情相對(duì)較重的患者CNPs比例明顯增加；在輕度牙周炎和中重度牙周炎患者的齦上牙石和齦下牙石均能分離出CNPs，但齦下牙石分離培養(yǎng)率更高，一方面可能由于齦下牙石附著于牙齒的時(shí)間更長(zhǎng)、更為堅(jiān)固，在樣本的處理過程中抵抗力更強(qiáng)，另一方面齦下菌斑的環(huán)境多為厭氧、細(xì)菌組成更為復(fù)雜，這樣的條件可能更有利于CNPs生長(zhǎng)；而比較不同牙位和不同性別的CNPs分離培養(yǎng)率，并未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別，分析其原因可能有：①CNPs不存在牙位特異性且性別并不是其危險(xiǎn)因素。②樣本量較小，不能更好地反映實(shí)際情況，下一步我們將增大樣本量繼續(xù)觀察以上指標(biāo)。在形態(tài)學(xué)方面，肉眼觀和光鏡下都發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加CNPs增加，連續(xù)觀察至12周未見其有停止增長(zhǎng)趨勢(shì)，在此過程中CNPs可能利用環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)成分不斷進(jìn)行自我復(fù)制；HE染色觀察到CNPs被染為深藍(lán)色、茜素紅鈣染色為橘色，提示該物質(zhì)中存在鈣鹽成分；透射電鏡顯示CNPs周圍有一層高密度影的圓形、卵圓形、短桿狀顆粒，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致[10-13]，這種形態(tài)可能是礦化外殼包裹所致，另外在部分CNPs內(nèi)部可觀察到空泡樣變性。大量研究認(rèn)為CNPs可以作為礦化核心，在生理性鈣磷濃度下引起礦物質(zhì)聚集，形成羥基磷灰石碳酸鹽結(jié)晶，在化學(xué)成分方面CNPs培養(yǎng)物與結(jié)石成分相似，因此它被認(rèn)為可能是導(dǎo)致結(jié)石形成的主要原因[14-15]。目前對(duì)于CNPs的爭(zhēng)議主要聚焦在其基因序列[16]，因此對(duì)其基因組的解析是今后研究工作的重點(diǎn)，與此同時(shí)，還可以通過動(dòng)物模型的建立探討CNPs形成機(jī)制。另外，蛋白礦物質(zhì)復(fù)合物學(xué)說中認(rèn)為胎球蛋白A、白蛋白作為雙重抑制因子與礦物質(zhì)離子存在平衡關(guān)系，當(dāng)?shù)V物質(zhì)離子濃度大于具有抑制作用的蛋白水平時(shí)結(jié)晶形成，而針對(duì)CNPs的特異性抗體被認(rèn)為與胎球蛋白A存在交叉反應(yīng)[17-18]，因此CNPs的生物學(xué)行為值得繼續(xù)深入研究。本實(shí)驗(yàn)從牙周病患者牙結(jié)石中成功分離出CNPs并對(duì)它的形態(tài)進(jìn)行了初步觀察，該物質(zhì)導(dǎo)致牙結(jié)石形成的具體機(jī)制、其對(duì)牙周組織可能造成的損傷以及是否存在基因序列和生物學(xué)特性值得進(jìn)一步探討。

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