淫羊藿苷脂固體質(zhì)納米粒制備工藝的優(yōu)化及其體外釋放研究

王安斌,李群芳,周旭美

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

淫羊霍，又稱仙靈脾，為小檗科植物淫羊霍(Epimedium brevicormon Maxim ) 的全草，味辛、甘，性溫，歸肝、腎兩經(jīng)，是祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的一種補(bǔ)益中藥，具有溫陽補(bǔ)腎、強(qiáng)筋健骨、祛風(fēng)除濕等功效[1]。淫羊藿苷(ICA)為淫羊藿所含黃酮類化合物的一種主要有效成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，ICA具有廣泛的生理活性，如增加心腦血管血流量、促進(jìn)造血功能、免疫功能及骨代謝，此外具有補(bǔ)腎壯陽、抗衰老、抗腫瘤等功效[2-4]。對(duì)ICA相關(guān)理化性質(zhì)研究表明[5]，ICA為水不溶性藥物，當(dāng)口服含ICA的相關(guān)藥物時(shí)，ICA在胃中比較穩(wěn)定，而當(dāng)ICA到達(dá)腸道時(shí)會(huì)很快發(fā)生代謝，其口服生物利用度較低。 因此，本實(shí)驗(yàn)從制劑學(xué)角度，利用現(xiàn)代化的納米載體技術(shù)對(duì)我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中藥淫羊藿中的主要有效成分ICA進(jìn)行新型制劑研究，采用單因素法優(yōu)化處方，制備ICA納米微粒。利用新型納米材料作為藥物載體材料，能有助于藥物釋放至有效血藥濃度范圍并能長(zhǎng)時(shí)間地將血藥濃度控制在該范圍內(nèi)，以減少給藥次數(shù)，減輕患者痛苦。固體脂質(zhì)納米粒( solid lipid nanoparticle，SLN) 作為一種有前景的新型藥物載體制劑，具有良好的生物組織相容性、穩(wěn)定性、靶向性、可控制藥物釋放和毒性低等特性[6-8]，能有效地保護(hù)被包載藥物不被胃腸道環(huán)境破壞并可達(dá)到控釋和緩釋的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀( 美國(guó)安捷倫公司)；色譜柱( 4.6×250mm，5μm，美國(guó)安捷倫公司)；TGL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器( 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；透析袋(截留分子量8000～14000，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司) 。

1.2 試劑 ICA原料藥( 純度>98%，南京澤朗醫(yī)藥有限公司)；ICA對(duì)照品( 純度>98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；大豆卵磷脂(上海源葉生物科技有限公司)；膽固醇( 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；泊洛沙姆188( 上海源葉生物科技有限公司)；PEG-2000(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司):甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 淫羊藿苷固體脂質(zhì)納米粒(ICA-SLN)的制備[9-10]采用改進(jìn)后的制備方法—超聲分散與高溫熔融-低溫固化結(jié)合法制備ICA-SLN，將脂質(zhì)材料與卵磷脂共同溶于無水乙醇中，超聲30 min，再將藥物與其混合加熱至70 ℃使其溶解，作為有機(jī)相；將乳化劑溶于水，超聲15 min，加熱至70 ℃作為水相；用注射器將有機(jī)相加入到攪拌的水相中，使有機(jī)溶劑揮發(fā)，恒溫?cái)嚢枞榛? h；濃縮液分散到20 mL冰水中，超聲30 min，冰浴攪拌1 h，即得ICA-SLN。

1.3.2 包封率及載藥量的測(cè)定

1.3.2.1 色譜條件 流動(dòng)相: 乙腈-水(30∶70)；體積流量：1.0 mL /min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm; 溫度：25 ℃。

1.3.2.2 包封率和載藥量測(cè)定采用聚結(jié)離心法測(cè)定[11]取ICA-SLN 200 μL 溶解于1 mL甲醇中，渦旋1 min， 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)樣20 μL，HPLC 檢測(cè)，計(jì)算藥物總量，記為W總。取ICA-SLN 1 mL，加入200 μL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液，4℃冷藏過夜后，12000 r·min-1離心10min，取上清液測(cè)定，計(jì)算游離藥物含量，記為W游。

包封率( %) = ( W總- W游) / W總× 100%

載藥量( %) = ( W總- W游) / W脂× 100%

1.3.3 優(yōu)選處方工藝 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的篩選及分析，本實(shí)驗(yàn)通過單因素法對(duì)處方進(jìn)行逐一篩選,以包封率和載藥量為驗(yàn)證指標(biāo)，確定大豆卵磷脂、膽固醇、投藥量、PEG-2000、F-68各指標(biāo)的取值范圍，從而得出較優(yōu)處方配比。

1.3.4 體外釋放特性 體外釋放實(shí)驗(yàn)[12-13]，參照中國(guó)藥典附錄，分別取制備好的ICA-SLN與ICA溶液10 mL置于透析袋中，封好兩端后置于盛有200 mL 釋放介質(zhì)的溶出杯中，以體積分?jǐn)?shù)30%甲醇磷酸鹽緩沖液(pH6.8) 為釋放介質(zhì)，在溫度(37±0.5) ℃、轉(zhuǎn)速為( 100±5)/min 條下透析，定時(shí)取樣2 mL，并及時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)量同溫度的溶出介質(zhì)，經(jīng)微孔濾膜( 0.45 μm) 過濾，用HPLC測(cè)定釋放液中游離ICA的濃度，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)藥物的累積釋放百分率，繪制累積釋放曲線。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取Ica對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇配成質(zhì)量濃度為4.8、48、96、192、288、384、480μg /mL 的對(duì)照品溶液，精密量取20 μL，注入色譜儀，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以峰面積( Y) 對(duì)濃度( X) 進(jìn)行線性回歸，等到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=37.442x+74.326。

2.2 處方優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn) 按1.3.3項(xiàng)下的操作進(jìn)行單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，由處方1～4，可知包封率與載藥量隨大豆卵磷脂用量的增加呈先增加后減小的趨勢(shì)；由處方5～8，可知載藥量隨膽固醇用量的增加呈先增加后減小的趨勢(shì)；由9～16，可知包封率隨ICA原料藥用量的不斷增加在5～40 mg時(shí)有顯著變化，隨著ICA原料藥用量的繼續(xù)增加包封率變化不明顯；由處方17～19，可知包封率與載藥量隨F-68用量的增加呈先增加后減小的趨勢(shì)；由處方20～23，可知包封率與載藥量隨PEG-2000用量的增加呈先增加后減小的趨勢(shì)。因此，確定了較優(yōu)處方配比為: 大豆卵磷脂為500 mg，膽固醇為150 mg，ICA為60 mg，F(xiàn)-68為200 mg，PEG-2000的用量為80 mg(見表1)。

表1優(yōu)化處方單因素實(shí)驗(yàn)

處方號(hào)卵磷脂(mg)膽固醇(mg)ICA(mg)PEG-2000(mg)F-68(mg)載藥量(%)包封率(%)1300150 10 50 1000.9180.5 2500150 10 50 1001.286.4 3600150 10 50 1001.0484.1 4700150 10 50 1000.483.16 550050 10 50 1000.9478.5 6500150 10 50 1001.286.4 7500200 10 50 1001.1385.55 8500300 10 50 1000.8688.11 9500150 5 50 1000.4566 10500150 10 50 1001.286.4 11500150 20 50 1002.290.2 12500150 30 50 1003.4994.17 13500150 40 50 1004.394.6 14500150 50 50 1005.0695.18 15500150 60 50 1005.7995.9 16500150 80 50 1009.496.8 17500150 60 50 1005.7995.9 18500150 60 50 2006.4797.27 19500150 60 50 3004.695.9 20500150 60 50 2006.4797.27 21500150 60 80 2006.5998.23 22500150 60 100 2006.594.3 23500150 60 150 2006.3793.12

2.3 優(yōu)化處方的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由優(yōu)化的處方按“1.3.1”項(xiàng)下方法，制備了3批ICA-SLN樣品，并按”1.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定樣品的包封率及載藥量。結(jié)果表明所選優(yōu)化處方，所制備3批樣品ICA-SLN包封率及載藥量的測(cè)定值較穩(wěn)定。因此可知，由改進(jìn)后的制備方法及所選優(yōu)化處方所制備ICA-SLN的成功率較高且較穩(wěn)定(見表2)。

表2優(yōu)化處方的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

樣品號(hào)包封率(%) 載藥量(%) 1 97.93 6.51 2 98.23 6.59 3 98.06 6.32x±s98.07±0.156 6.47±0.139

2.4 體外釋放實(shí)驗(yàn) 按“1.3.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，ICA在30%的甲醇PBS溶液中一直以較快速度釋放，9 h內(nèi)累積釋放率達(dá)到99.97%；而ICA-SLN在30%的甲醇PBS溶液中，8 h前釋放速度較快，8 h后以較為緩和的速度釋放逐漸趨于勻速釋放，72 h內(nèi)累積釋放率達(dá)到89.75%(見圖1)。

圖1 ICA與ICA-SLN的體外釋放百分曲線

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用了改進(jìn)后的制備方法——超聲分散與高溫融溶低溫固化結(jié)合法制備ICA-SLN，該方法在原有高溫融溶低溫固化的方法上加入了超聲法，利用了超聲有助于物質(zhì)分散的特點(diǎn)，一方面能使有機(jī)相和水相在高溫熔融步驟更好的融合，另一方面也能使形成的脂質(zhì)體在低溫固化步驟能夠更好的分散開。從而，制備出具有較高包封率和載藥量的ICA-SLN。通過對(duì)該處方所制備的ICA-SLN進(jìn)行測(cè)定，得到包封率為98.23%，載藥量為6.59%，與單一的高溫融溶低溫固化制備法相比，該方法所制備ICA-SLN有較高包封率、載藥量及較好緩釋效果。而且通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知該制備方法穩(wěn)定性較好。

處方優(yōu)化上，本實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)通過正交法來優(yōu)化設(shè)計(jì)處方，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不理想，較難得到較優(yōu)處方。因此，本實(shí)驗(yàn)采用了單因素逐個(gè)篩選的方法制備ICA-SLN，再結(jié)合包封率與載藥量作為評(píng)判指標(biāo)對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化，選取較優(yōu)處方。最后得到較優(yōu)處方為：大豆卵磷脂為500 mg，膽固醇為150 mg，ICA為60 mg，F(xiàn)-68為200 mg，PEG-2000為80 mg。

通過對(duì)ICA與該優(yōu)化處方所制備出的ICA-SLN進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，所制備的ICA-SLN與ICA相比具有更好的緩釋效果。由圖1可知，ICA從釋放開始便以較快的速度釋放，在短時(shí)間內(nèi)便完全釋放。而ICA-SLN開始釋藥時(shí)存在一個(gè)突釋現(xiàn)象，主要的原因可能是因?yàn)橐恍┪幢话d的藥物吸附在納米粒子的表面，因此在體外釋放初期這部分藥物便以較快的速度釋放到介質(zhì)中；另一種原因可能是由于部分納米粒子的破裂及部分乳化劑被同時(shí)包裹于脂質(zhì)骨架表層中，也導(dǎo)致了藥物的突釋現(xiàn)象。待釋放一段時(shí)間，釋藥速度逐漸緩慢，之后便以較為恒定的速度釋放，此階段即是被包載藥物的釋放。因此，ICA-SLN完全釋放需要較長(zhǎng)時(shí)間，其充分的展現(xiàn)了所制備ICA-SLN的緩釋效果。

本實(shí)驗(yàn)采用了改進(jìn)后的制備方法——超聲分散與高溫融溶低溫固化結(jié)合法制備ICA-SLN；還探討了關(guān)于單因素法的方法較正交法更適合本實(shí)驗(yàn)篩選出較優(yōu)處方；且篩選優(yōu)化出的較優(yōu)處方，通過改進(jìn)后制備法所制備的ICA-SLN與單一高溫融溶低溫固化制備法相比，改進(jìn)后制備法所制備的ICA-SLN具有較高包封率、載藥量及較好的緩釋效果，由處方優(yōu)化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知改進(jìn)后的制備方法制備ICA-SLN成功率較高。然而該納米制劑在體內(nèi)能否也具有同樣的緩釋效果，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

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