淫羊藿苷上調(diào)PPARα和PGC-1α蛋白的表達改善慢性腦低灌注大鼠模型的空間學習記憶

李雯嫻，鄧媛媛，石京山，李 菲，劉 波，龔其海

(遵義醫(yī)學院 藥理學教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室, 貴州 遵義 563099)

腦血流減少是老年人認知功能障礙的重要危險因素之一，其引起的慢性腦低灌注可加快老年癡呆的病程。臨床研究發(fā)現(xiàn)，輕度認知障礙患者存在腦血流減少。因此，慢性腦低灌注被認為是導(dǎo)致老年人認知障礙、輕度認知損害、血管性癡呆和遲發(fā)性阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的關(guān)鍵因素[1-3]。盡管慢性腦低灌注引起的認知缺陷的發(fā)病機制已取得顯著進展，但目前仍缺乏理想的藥物治療。因此，繼續(xù)研究抗慢性腦低灌注所致認知功能減退的藥物意義重大。

淫羊藿苷(icariin, ICA)是淫羊藿的主要成分之一。研究表明，ICA可改善由脂多糖引起的腦功能障礙，抑制神經(jīng)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的細胞凋亡，具有抗炎和神經(jīng)保護作用[4-5]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，ICA可改善腦慢性低灌注誘導(dǎo)的大鼠學習記憶減退[6]，但其作用機制尚不完全清楚。因此，本文觀察了ICA對雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎所致大鼠慢性腦缺血模型空間學習記憶減退的影響，并探索其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性SD大鼠60只，SPF級，體重250±20g, 購自重慶第三軍醫(yī)大學動物實驗中心，合格證號：SCXK-( 渝) 2007-00005。

1.1.2 試劑和藥品 淫羊藿苷購自南京澤朗醫(yī)藥有限公司(純度經(jīng)HPLC檢測大于98%)；PPARα和PGC-1α抗體購于英國Abcam公司。

1.1.3 儀器 MT-200 Morris水迷宮，成都泰盟科技公司；全自動凝膠圖象分析儀，美國BIO-RAD公司；i-mark酶標儀，美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和造模 60只大鼠，隨機分為4組：假手術(shù)組、模型組、低和高劑量ICA治療組( 10、40 mg/kg) (n=15)。模型組、ICA低和高劑量組用絲線將雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎，假手術(shù)組只分離出頸總動脈, 不結(jié)扎。造模10 d后，ICA低、高劑量組分別連續(xù)灌胃ICA10、40 mg/kg ，連續(xù)23 d，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積生理鹽水。

1.2.2 Morris水迷宮 造模后第28天進行水迷宮檢測。方法參照本研究組既往方法進行[7]。

1.2.3 Western blot測定蛋白表達 水迷宮檢測結(jié)束后，處死大鼠，取海馬。稱取100 mg海馬組織，勻漿離心取上清液。在570 nm波長處，用酶標儀進行檢測樣品和標準品吸光度值, 根據(jù)標準品吸光度值和標準品已知濃度作標準曲線，計算上清液蛋白濃度，8% SDS-PAG凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜, 封閉、抗體孵育，ECL發(fā)光顯影，實驗結(jié)果采用凝膠成像系統(tǒng)測定泳帶光密度積分值, 并與相應(yīng)內(nèi)參的積分光密度值比較, 得出各蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 ICA對大鼠空間學習記憶功能的影響 給藥后第18天，Morris水迷宮檢測了大鼠空間學習記憶功能。定位航行實驗中，第1天各組間運動距離無統(tǒng)計學意義。第2、3、4天，與假手術(shù)相比，模型組運動距離明顯增加(P<0.05)，與模型組比較，ICA低、高劑量組大鼠的運動距離明顯縮短(P<0.01，P<0.05)。空間探索實驗中，模型組大鼠在目標象限的停留時間明顯低于假手術(shù)組 (P<0.05)，這表明雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎可使大鼠的空間學習記憶功能減退。而在ICA灌胃23 d后，低、高劑量組大鼠的目標象限停留時間較模型組明顯延長(P<0.05)，表明ICA可減輕雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎所致大鼠的空間學習記憶功能減退(見表1，表2)。

組別n第1天 (m)第2天 (m)第3天 (m)第4天 (m)假手術(shù)組1039.5±3.411.9±2.29.2±0.95.7±0.8模型組1045.6±3.420.9±2.9*17.4±3.3*10.8±2.1*ICA低劑量組1037.8±2.610.7±1.1##7.8±1.2#5.0±1.0#ICA高劑量組1235.7±4.212.9±1.7#9.5±1.0#6.2±0.6#

與假手術(shù)組比較*P<0.05,與模型組比較 ##P<0.01，#P<0.05。

組別n第5天 (s)假手術(shù)組1032.0±3.3模型組1025.1±2.9*ICA低劑量組1030.9±3.6#ICA高劑量組 1229.2±3.3#

與假手術(shù)組比較*P<0.05,與模型組比較 #P<0.05 。

2.2 ICA對海馬組織PPARα和PGC-1α蛋白表達的影響 水迷宮檢測結(jié)束后，Western blot法檢測了大鼠海馬PPARα和PGC-1α蛋白表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬的PPARα和PGC-1α蛋白表達均較假手術(shù)組明顯降低(P<0.01，P<0.05)；然而，與模型組比較，ICA低、高劑量組大鼠海馬的PPARα和PGC-1α蛋白表達均明顯上調(diào)(分別P<0.01，P<0.05,見圖1)。

以假手術(shù)組為1，其他組與其進行比較。**P<0.01,*P<0.05 versus sham group, ## P<0.01， # P<0.05 versus BCCAO group (n=3)。圖1 ICA對海馬組織PPARα和PGC-1α蛋白表達的影響

3 討論

本研究首先探索了ICA對慢性腦低灌注模型的有效劑量。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，30～120 mg/kgICA對該模型慢性低灌注大鼠的學習記憶具有改善作用[6]，因此，本實驗探究更低劑量的ICA對該模型是否具有改善作用并進一步探究其作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ICA10、40 mg/kg對雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎致腦慢性低灌注大鼠的學習記憶具有改善作用。此外，模型組PPARα和PGC-1α蛋白的表達均下調(diào)，而給予ICA10、40 mg/kg能使其表達上調(diào)。

雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠學習記憶減退是一種合適的腦慢性低灌注模型，可以較好地模仿VD和AD的病理特征，被廣泛用于實驗研究[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎可誘導(dǎo)的大鼠學習記憶減退，提示本模型成功。胰島素抵抗與VD或AD的病理密切相關(guān)，高胰島素血癥誘導(dǎo)的胰島素抵抗可增加VD或AD的發(fā)病率[9]。此外，甚至有學者提出AD是3型糖尿病，在胰島素抵抗中，胰島素水平異常升高，增加的胰島素與胰島素降解酶競爭Aβ，導(dǎo)致Aβ不能有效降解并在腦內(nèi)沉積，最后導(dǎo)致VD或AD。

本研究檢測了PPARs的PPARα的表達。研究發(fā)現(xiàn), ICA能夠阻遏腦慢性缺血誘導(dǎo)的PPARα蛋白表達下降，表明ICA對中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的PPARα具有激動作用。PPARs是配體激活轉(zhuǎn)錄因子受體，屬于核受體家族，其3種亞型(α，β/δ和γ)參與脂質(zhì)和葡萄糖代謝和調(diào)節(jié)。雖然PPARs的3種亞型都存在于成人大腦中，但PPARα和PPARγ是研究得較多的異構(gòu)體[10]。PPARα的激活可誘導(dǎo)不同器官的抗炎和抗氧化作用。在腦缺血模型中，PPARα激動劑非諾貝特和WY-14643預(yù)防性給藥3d和7d，可產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[11]。本研究結(jié)果與既往研究一致，提示PPARα可能是ICA抗慢性腦低灌注所致大鼠學習記憶減退的作用靶點之一。

PGC-1α是能量代謝和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，與糖尿病和肥胖的代謝紊亂有關(guān)。PGC-1α的過度表達可誘導(dǎo)大鼠原代培養(yǎng)骨骼肌細胞中PPARα的表達增加，提示PGC-1α可能通過PPARα信號導(dǎo)致胰島素抵抗[12]。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)，短暫腦缺血實驗?zāi)Ｐ椭?，PGC-1α信號通路的激活可以防止遲發(fā)性海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡[13]。此外，PPAR激動劑可以通過PGC-1α誘導(dǎo)的線粒體融合裂變動態(tài)過程，這個過程可阻止氧化應(yīng)激對線粒體功能的損害，從而保護海馬神經(jīng)元線粒體功能[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，ICA能夠阻遏慢性腦缺血誘導(dǎo)的PGC-1α和PPARα的表達下降，提示PGC-1α可能通過PPARα信號對腦慢性低灌注大鼠起神經(jīng)保護作用，從而改善大鼠學習記憶功能。

綜上所述，本研究進一步揭示了ICA可改善腦慢性腦低灌注誘導(dǎo)的大鼠空間學習記憶減退，其機制至少與上調(diào)PPARα和PGC-1α蛋白的表達有關(guān)。因此，ICA有望成為治療抗慢性腦低灌注相關(guān)疾病如AD及VD的藥物，值得進一步研發(fā)。

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