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    蟲(chóng)草菌高附加值活性次生代謝產(chǎn)物的多樣性及二次性開(kāi)發(fā)利用

    2014-08-13 06:53:34肖建輝
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞毒冬蟲(chóng)夏草蟲(chóng)草

    肖建輝

    (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院暨貴州省細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099)

    蟲(chóng)草,非指蟲(chóng)與草,而是蟲(chóng)與菌,亦是蟲(chóng)草屬Cordyceps (Frey) Link中所有真菌的統(tǒng)稱(chēng)。其中冬蟲(chóng)夏草Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.(=Ophiocordyceps sinensis)是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴珍稀滋補(bǔ)中藥材,應(yīng)用歷史久遠(yuǎn),頗受華人青睞。應(yīng)用蟲(chóng)草的最早文字記載,可追溯到1300余年前唐代《月王藥診》和《藏本草》,稱(chēng)其“潤(rùn)肺、補(bǔ)腎”。近20余年來(lái),蟲(chóng)草已成為國(guó)內(nèi)外生物醫(yī)藥領(lǐng)域的熱點(diǎn)話(huà)題[1]。

    蟲(chóng)草菌物種豐富多樣。英國(guó)CABI databases登載的蟲(chóng)草菌有500余種(http://www.speciesfungorum.org)。排除同物異名因素,學(xué)術(shù)界公認(rèn)的蟲(chóng)草物種約400種[2-3],其中我國(guó)報(bào)道了近100種[4]。在這數(shù)百種蟲(chóng)草菌中,冬蟲(chóng)夏草與人參、鹿茸齊名,位居我國(guó)3大名貴滋補(bǔ)中藥之首。遺憾的是,這種聲名深刻影響了冬蟲(chóng)夏草資源的可持續(xù)利用。一方面該物種野生資源數(shù)量受自身生物學(xué)特性嚴(yán)格限制,而規(guī)?;斯ぴ耘嗥裆形磳?shí)現(xiàn),供給極其有限;另一方面,人民生活水平提高及中醫(yī)藥歷史文化影響,市場(chǎng)需求旺盛。從而導(dǎo)致近10年來(lái)冬蟲(chóng)夏草價(jià)格飆升,賽過(guò)黃金。更嚴(yán)重的是,長(zhǎng)期以來(lái)受利益驅(qū)動(dòng),人們無(wú)序、掠奪式采挖,使本來(lái)脆弱的、冬蟲(chóng)夏草賴(lài)以生存的生態(tài)環(huán)境遭受毀滅性破壞,野生資源瀕臨枯竭[3-4],已成為制約蟲(chóng)草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。冬蟲(chóng)夏草真的有出神入化的功效嗎?現(xiàn)代中藥化學(xué)的研究結(jié)果并無(wú)重要發(fā)現(xiàn),使一些國(guó)內(nèi)外學(xué)者不得不懷疑[5]。不過(guò),作為一種食用了千余年的名貴中藥,其藥性是不容質(zhì)疑的。也許是我們尚未發(fā)現(xiàn)它為什么和怎樣發(fā)揮功效的科學(xué)證據(jù),而這涉及到蟲(chóng)草產(chǎn)業(yè)的未來(lái)發(fā)展方向。目前蟲(chóng)草制品主要是原料級(jí)生藥或一次性粗制品,而市場(chǎng)鮮見(jiàn)高技術(shù)高附加值二次性產(chǎn)品,蟲(chóng)草產(chǎn)業(yè)亟待轉(zhuǎn)型升級(jí)。另外,冬蟲(chóng)夏草已成瀕危物種?;谏飬f(xié)同進(jìn)化理論,我們是否能在400多個(gè)蟲(chóng)草物種中,找到冬蟲(chóng)夏草的替代資源或者更具研發(fā)潛力的新資源?大量的研究表明,許多蟲(chóng)草物種具有替代冬蟲(chóng)夏草潛力,它們有類(lèi)似的化學(xué)成分和藥理作用[4,6],乃至存在冬蟲(chóng)夏草不具有的新物質(zhì)與新功效。

    綜上所述,基于讓人們更好地認(rèn)識(shí)蟲(chóng)草資源未來(lái)深度開(kāi)發(fā)利用的方向,本文擬評(píng)述蟲(chóng)草高附加值活性物質(zhì)多樣性的進(jìn)展,為該類(lèi)資源深度開(kāi)發(fā)利用提供新思路。

    1 蟲(chóng)草活性次生代謝物的多樣性

    蟲(chóng)草菌與寄主昆蟲(chóng)或節(jié)肢動(dòng)物的關(guān)系,寄生或共生?迄今仍存爭(zhēng)議[7]。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,為克服入侵時(shí)寄主的天然屏障,以及逃避侵入后寄主的免疫監(jiān)控,達(dá)成與寄主的生活史同步化,最終完成自身細(xì)胞增殖、分化和整個(gè)生活史。在這個(gè)過(guò)程中,生成了與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、應(yīng)激保護(hù)相關(guān)的,具有化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣、生物功能多樣和作用多靶點(diǎn)等特點(diǎn)的“功能性”活性代謝物[6, 8],并彰顯具創(chuàng)制藥物的巨大潛力[6, 8-9]。近些年來(lái),隨著天然產(chǎn)物化學(xué)和現(xiàn)代色譜技術(shù)的飛速發(fā)展,人們對(duì)蟲(chóng)草原料或粗提物的一次性直接利用,應(yīng)該逐步過(guò)度到更高層次二次性化學(xué)成分的研發(fā),即化學(xué)成分與藥理作用點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的研究。由此,蟲(chóng)草次生代謝產(chǎn)物的研究日益成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),現(xiàn)已報(bào)道的代謝產(chǎn)物主要可概括為以下幾大類(lèi):

    1.1 生物堿類(lèi)次生代謝產(chǎn)物 早在1950年,Cunningham等在蛹蟲(chóng)草菌中分離到一種抗菌的代謝產(chǎn)物,定名為蟲(chóng)草素(cordycepin),化學(xué)名為3’-脫氧腺苷(C10H13N5O3),并發(fā)表在Nature雜志上。隨后數(shù)10年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蟲(chóng)草素的來(lái)源、生物高效合成與分離制備,人工合成與修飾、藥理活性及作用機(jī)制等方面進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。結(jié)果表明,蟲(chóng)草素不僅有明顯的抗菌、抗病毒和殺蟲(chóng)功效[10-12],還有顯著的抗腫瘤作用[13],是一種廣譜抗生素。遺憾的是,肌體內(nèi)腺苷脫氨酶(adenosine deaminase,ADA)可使蟲(chóng)草素脫氨,而生成3’-脫氧次黃嘌呤核苷,活性顯著降低,使其成藥性受到極大挑戰(zhàn)。所幸的是,ADA抑制劑可延緩蟲(chóng)草素在體內(nèi)的代謝,給其臨床應(yīng)用帶來(lái)了轉(zhuǎn)機(jī)[14]。Furuya等[4]在粉被蟲(chóng)草中,首次發(fā)現(xiàn)了生物來(lái)源的Ca2+拮抗劑,命名為N6-(2-羥乙基)腺苷(C12H17N5O5, N6-(2-hydroxyethyl)adenosine)。

    吡啶酮類(lèi)化合物是近些年報(bào)道的一類(lèi)新的活性生物堿,有一定的抗腫瘤細(xì)胞毒活性。Isaka等[15]自C. nipponica菌中分離獲得N-羥基及N-甲氧基吡啶酮,命名為cordypyridones A-D(見(jiàn)圖1)。其中N-羥基吡啶酮cordypyridones A和B(C16H23NO3)是同分異構(gòu)體,均有顯著抗瘧原蟲(chóng)活性,IC50值分別是0.066、0.037 μg/mL,但其抗腫瘤細(xì)胞毒性較弱。之后,德國(guó)學(xué)者Schmidt等[16-17]在蛹蟲(chóng)草菌中發(fā)現(xiàn)了吡啶酮生物堿militarinone A(C26H37NO6)和D(C26H31NO4),以及3-?;陌匪?tetramic acid) militarinone B(C26H33NO5)和C (C26H33NO4,圖1),并認(rèn)為militarinones C、B、D是A生物代謝合成途徑的中間體。細(xì)胞毒活性結(jié)果提示,militarinone D對(duì)PC-12細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用,而militarinones A、B和C沒(méi)有細(xì)胞毒效應(yīng)或不明顯。有趣的是,Cheng等[18]自蟲(chóng)花棒束孢Paecilomyces farinosus (異名又稱(chēng)Isaria farinosa)中分離獲得的脫氧militarinone A(C26H37NO5, 圖1),對(duì)人神經(jīng)元IMR-32細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用。Cheng等[19]還從該菌中分離到兩個(gè)新的吡啶酮生物堿farinosone A (C25H27NO4)和B (C25H27NO5),以及吡啶酮生物合成途徑的中間體farinosone C (C19H25NO5, 圖1),這幾個(gè)化合物對(duì)PC-12細(xì)胞均無(wú)細(xì)胞毒效應(yīng)。但是,Lang 等[20]從蟲(chóng)花棒束孢中分離獲得兩個(gè)化合物,farinosone B和一個(gè)新的四胺酸(tetramic acid)衍生物paecilosetin(C22H31NO4, 圖1)。它們對(duì)小鼠白血病P388細(xì)胞均有明顯的細(xì)胞毒效應(yīng)。近來(lái),Che研究組[21]從冬蟲(chóng)夏草定殖真菌蟲(chóng)花棒束孢Isaria farinosa中也分離到militarinones A和B,并獲得兩個(gè)新的N-羥基吡啶酮militarinones E和F,兩個(gè)新苯腙化合物farylhydrazones A和B,以及一個(gè)新喹唑酮化合物2-(4-hydroxybenzyl)quinazolin-4(3H)-one(見(jiàn)圖1)。活性檢測(cè)的結(jié)果提示,militarinones A和E對(duì)肺癌A549細(xì)胞有顯著的抗腫瘤細(xì)胞毒活性,而militarinones B呈現(xiàn)抗菌活性。這與Schmidt等報(bào)道m(xù)ilitarinones A未檢測(cè)到其明顯的細(xì)胞毒性不一致,可能與選擇的細(xì)胞株有關(guān)。因此,militarinones A對(duì)腫瘤細(xì)胞可能存在選擇毒性。

    不僅蟲(chóng)花棒束孢含有豐富的生物堿類(lèi)物質(zhì),也從其它蟲(chóng)草棒束孢發(fā)現(xiàn)許多有潛在價(jià)值的生物堿。細(xì)腳棒束孢Isaria tenuipes(又稱(chēng)高雄山蟲(chóng)草菌)是在東南亞利用比較廣的一種蟲(chóng)草菌。Isaka研究組[22-23]先后從細(xì)腳棒束孢兩個(gè)菌株中獲得6個(gè)新生物堿isariotins A-F (見(jiàn)圖1) 和一個(gè)已知化合物TK-57-164A。其中isariotins A-D帶獨(dú)特的雙環(huán)[3.3.1]壬烷環(huán),而isariotins E和F帶有螺環(huán)或雙環(huán)半縮醛。Isariotins F有良好的抗惡性瘧原蟲(chóng)Plasmodium falciparum K1活性(IC50=5.1μM),且對(duì)乳腺癌BC細(xì)胞和肺癌NCI-H187細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒活性,其IC50分別為2.4和1.6μM。日本棒束孢Isaria japonica(或日本蟲(chóng)草C. japonica),也稱(chēng)叫大孢蟲(chóng)花,其在日本廣為利用。Lee研究組[24]從該蟲(chóng)草菌中分離到一種新的嗎啉衍生物(3R,6R)-4-甲基-6-(1-甲基乙基)-3-苯基甲基全氫化-1,4-噁嗪-2,5-二酮(C15H19NO3,圖1中化合物1) 和兩種已知的嗎啉衍生物lateritin與bassiatin,并發(fā)現(xiàn)這個(gè)新的化合物能誘導(dǎo)人白細(xì)胞HL-60細(xì)胞凋亡。另外,Chou研究組[25]從蟬花上也分離到bassiatin,并第1次獲得天然來(lái)源的bassiatin A (見(jiàn)圖1)。

    另外,Isaka研究組[26]從Cordyceps brunnearubra BCC 1395菌中獲得青黃霉素類(lèi)生物堿cordyformamide,可能是青黃霉素 Y2的前體物,有中等抗瘧原蟲(chóng)活性,但無(wú)細(xì)胞毒作用。最近,Yang等[27]在發(fā)掘冬蟲(chóng)夏草菌抗炎的物質(zhì)基礎(chǔ)過(guò)程,分離鑒定了50次生代謝物,其中5個(gè)新化合物命名為cordysinin A, B, C, D和E (見(jiàn)圖1),僅cordysinin A有較弱的抗炎活性。但45個(gè)已知化合物中,發(fā)現(xiàn)生物堿perlolyrine(1-(5-Hydroxymethyl-2-furyl)-β-carboline,C16H12N2O2)有顯著的抗炎潛力。

    1.2 多肽類(lèi)次生代謝產(chǎn)物 小分子多肽是藥物研發(fā)關(guān)注的熱點(diǎn)之一,它在肌體內(nèi)有清除率高、半衰期短,且毒副作用小等特點(diǎn)。上世紀(jì)60年代末,Hamill等 (1969) 在昆蟲(chóng)病原真菌球孢白僵菌Beauveria bassiana中獲得一種強(qiáng)殺蟲(chóng)活性的環(huán)己縮酚,命名為肽白僵菌素(Beauvericin,C45H57N3O9, 圖2)。之后,在蟬花、高雄山蟲(chóng)草等多種蟲(chóng)草菌中分離到白僵菌素[25, 28-29]。Chou研究組[25]在蟬花中還獲得兩種白僵菌素的衍生物beauvericins A和B。白僵菌素可作為細(xì)胞內(nèi)的離子載體,而對(duì)胞內(nèi)電解質(zhì)與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起調(diào)節(jié)作用[30],其還有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[28,31]。白僵菌素的抗腫瘤作用機(jī)制主要涉及激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+,致Ca2+大量釋放到胞漿激活細(xì)胞凋亡路徑[32-33]。2000年,姜泓等從蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中分離鑒定了一種蟲(chóng)草環(huán)肽A(cordycepeptide A,C27H41N3O5, 圖2)。之后,吳立軍研究組(2003)從蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)液中分離到環(huán)(苯丙氨酸-脯氨酸)、環(huán)(亮氨酸-脯氨酸)、環(huán)(纈氨酸-脯氨酸)和環(huán)(丙氨酸-脯氨酸等數(shù)個(gè)環(huán)二肽。這幾種環(huán)肽的活性未見(jiàn)進(jìn)一步的報(bào)道。不過(guò),該研究組從冬蟲(chóng)夏草培養(yǎng)液分離到一種環(huán)二肽,命名cordycedipeptide A(C10H17N3O3,圖2),其對(duì)L-929、A375和Hela等腫瘤細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒作用[34]。Krasnoff研究組[35]從異足蛛蟲(chóng)草菌C. heteropoda中分離到兩個(gè)具有抗菌作用的線(xiàn)性七肽cicadapeptins I和II(見(jiàn)圖2)。Rukachaisirikul等[36]從未鑒定蟲(chóng)草Cordyceps sp. BCC 1788菌株中分離到一種環(huán)七肽,定名為cordyheptapeptide A(C49H65N7O8,圖2),其對(duì)Vero細(xì)胞有細(xì)胞毒活性。Sakakura等從棒束孢蟲(chóng)草中分離獲得一個(gè)新的擬二肽,命名為hanasanagin(見(jiàn)圖2),具有明顯的抗氧化作用[37]。最近,Asai等[38]從C. indigotica Kobayasi & Shimizu菌培養(yǎng)液中分離獲得了8種已知環(huán)狀縮酚肽類(lèi)化合物,即腐敗菌素(destruxins)A, A2, B, B2和E(見(jiàn)圖2)。

    圖1 蟲(chóng)草菌的生物堿類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)圖

    圖2 蟲(chóng)草菌的多肽類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)圖

    1.3 甾醇類(lèi)次生代謝產(chǎn)物 Kuo等在1990年代初,自冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體中獲得兩個(gè)組分CS-36-39 和CS-48-51,其對(duì)多個(gè)腫瘤細(xì)胞株具有顯著細(xì)胞毒效應(yīng),進(jìn)一步的化學(xué)分析提示,這個(gè)兩個(gè)組分非多糖和蟲(chóng)草素。之后,Bok等 (1999) 在冬蟲(chóng)夏草菌絲體中獲得兩個(gè)新的抗腫瘤甾醇次生代謝物,即5α,8α-表二氧-24(R)-甲基膽甾烷-6,22-二烯-3β-D-吡喃葡萄糖(C34H54O8,圖3中化合物1)和5α,6α-環(huán)氧-24(R)- 甲基膽甾烷-7,22-二烯-3β-醇(C28H44O2, 圖3化合物2)。同時(shí)得到兩個(gè)已知麥角甾醇衍生物 (見(jiàn)圖3化合物3與4)。而且,其抗腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,化合物1的葡萄糖配基是個(gè)增效基團(tuán),可明顯提高其抗腫瘤作用。Kuo等[25]從蟬花中分離獲得兩個(gè)甾醇類(lèi)物質(zhì),麥角甾醇及其過(guò)氧化物5α,8α-表二氧-24(R)-甲基膽甾烷-6,22-二烯-3β-醇(C28H44O3)(圖3中化合物5和6),但未進(jìn)行活性評(píng)價(jià)。不過(guò),Nam等[39]對(duì)從高雄山蟲(chóng)草中獲得的5α,8α-表二氧-24(R)-甲基膽甾烷-6,22-二烯-3β-醇進(jìn)行了活性評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)其可抑制人胃癌SNU-1、肝癌SNU-354、結(jié)腸直腸癌SNU-C4和鼠肉瘤S180等多種腫瘤細(xì)胞增殖。最近,我們研究組從江西蟲(chóng)草菌中獲得一種極有創(chuàng)制抗腫瘤新藥潛力的新化合物jiangxienone(見(jiàn)圖3中化合物7),其對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的殺傷能力是一線(xiàn)抗腫瘤藥物順鉑的至少6倍,且對(duì)正常細(xì)胞毒性小[40],其作用機(jī)制經(jīng)由DNA損傷修復(fù)途徑[41]。

    圖3 蟲(chóng)草菌的甾醇類(lèi)化合物

    1.4 萜類(lèi)次生代謝產(chǎn)物 蟲(chóng)草菌中含有豐富的萜類(lèi)化合物。真菌毒素有一類(lèi)重要的萜類(lèi)化合物叫單端孢霉烯(trichothecane)。Nam等[39]在高雄山蟲(chóng)草菌中分離獲得一個(gè)單端孢霉烯類(lèi)化合物,命名為4β-乙酰氧藨鐮刀菌烯-3α,15-二醇(acetoxyscirpenediol)(C17H24O6,圖4化合物1),其抗腫瘤細(xì)胞毒效應(yīng)是臨床一線(xiàn)抗癌藥物順鉑的4~6倍。其抗腫瘤細(xì)胞毒效應(yīng)的作用機(jī)制結(jié)果提示,4β-乙酰氧藨鐮刀菌烯-3α,15-二醇主要經(jīng)由誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[42]。Chung研究組[43-45]從日本棒束孢中分離鑒定了一種單端孢霉烯衍生物,4-乙?;?12,13-環(huán)氧基-9-單端孢霉烯-3,15-二醇(見(jiàn)圖4中化合物2)。該化合物抗癌譜廣,對(duì)白血病、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌等多種腫瘤細(xì)胞株均有抑制效應(yīng)。進(jìn)一步的研究提示,它的作用機(jī)制與Caspase依賴(lài)凋亡途徑有關(guān),即通過(guò)促進(jìn)胞內(nèi)活性氧生成,使胞內(nèi)谷胱甘肽抗氧化劑缺失,并激活Caspase-3凋亡酶,最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此,來(lái)源蟲(chóng)草的單端孢霉烯具有創(chuàng)制抗癌藥物的潛力。之后,Oshima研究組[46-48]先后從高雄山蟲(chóng)草菌中分離鑒定了6個(gè)新單端孢霉烯衍生物,其中paecilomycines A(C15H22O4)、B(C15H22O5)和C(C15H20O4)是帶有三環(huán)結(jié)構(gòu)的倍半萜(見(jiàn)圖4),spirotenuipesines A (C15H22O4)和B(C15H22O5)是既帶有三環(huán)結(jié)構(gòu)又有螺環(huán)結(jié)構(gòu)的倍半萜(見(jiàn)圖4),而tenuipesine A 是帶環(huán)丙烷環(huán)的新骨架單端孢霉烯?;钚栽u(píng)價(jià)結(jié)果提示,倍半萜paecilomycine A、spirotenuipesine A和B可促使人星形細(xì)胞瘤1321N1細(xì)胞分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,誘導(dǎo)鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞分化。綜上,高雄山蟲(chóng)草稱(chēng)得上是生物合成新穎單端孢霉烯類(lèi)化合物的細(xì)胞工廠。本項(xiàng)目組先后從戴氏蟲(chóng)草菌和江西蟲(chóng)草菌中分離到四環(huán)三萜化合物helvolic acid,其對(duì)多個(gè)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)均有抑制作用,尤其是對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒性[49-50]。

    圖4 蟲(chóng)草菌的萜類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)圖

    1.5 聚酮類(lèi)次生代謝產(chǎn)物 近些年來(lái),在蟲(chóng)草菌中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)聚酮類(lèi)次生代謝產(chǎn)物,具有結(jié)構(gòu)和生物活性多樣等特點(diǎn)。Seephonkai等[51]從一種未鑒定的蟲(chóng)草菌Cordyceps sp. BCC 1681中分離到類(lèi)似環(huán)庚三烯酚酮的次生代謝物,命名為cordytropolone(C9H8O4,圖5)。該化合物呈現(xiàn)中等的抗惡性瘧原蟲(chóng)Plasmodium falciparum K1與抗乳腺癌BC-1細(xì)胞毒活性(IC50=2.2μg/mL)。最近,Grudniewska等[52]從也一株未鑒定的蟲(chóng)草菌Cordyceps sp. NBRC 106954 獲得了一個(gè)特殊骨架的聚酮化合物Opaliferin(見(jiàn)圖5),其通過(guò)一個(gè)外部雙鍵,把環(huán)戊酮和四氫呋喃鏈接在一起,但其功能活性尚待進(jìn)一步研究。

    一個(gè)不可忽視的生物現(xiàn)象是,真菌中許多代謝途徑的次生代謝物質(zhì)合成基因在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件下并不表達(dá)。日本學(xué)者Asai研究組近幾年的工作提示,表觀遺傳改良劑對(duì)蟲(chóng)草菌聚酮類(lèi)次生代謝產(chǎn)物合成有重要影響。Asai等[53]在C. indigotica Kobayasi & Shimizu菌發(fā)酵液中分離到1個(gè)新的芳香聚酮糖苷類(lèi)化合物indigotide A(C21H26O9,圖5),以及1個(gè)已知的聚酮類(lèi)化合物NG-393(C22H28NO7,圖5)。有趣的是,在該菌培養(yǎng)液中加入表觀遺傳抑制劑5-氮雜胞苷(DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑)后,其代謝合成另一個(gè)新的芳香聚酮糖苷類(lèi)化合物indigotide B(C22H26O10,圖5)。而添加另一種表觀遺傳改良劑軟木肟酸(組蛋白脫乙?;敢种苿?到該菌培養(yǎng)液后,不僅分離獲得了indigotide A和B(見(jiàn)圖5),還獲得6種新的芳香聚酮類(lèi)化合物indigotide C (C42H52O18,圖5)、D(C42H52O18,圖5)、E(C43H52O19,圖5)和F(C15H18O5,圖5),以及13-hydroxyindigotide A(C21H26O10,圖5),8-O-methylindigotide B(C23H28O10)[54]。因此表觀遺傳改良劑對(duì)蟲(chóng)草菌的生物代謝合成有重要影響,將可有效喚醒編碼次生代謝產(chǎn)物的沉默基因簇,從而使蟲(chóng)草菌合成一些新穎的具有潛在功效的次生活性代謝物。不過(guò),這些新聚酮類(lèi)化合物的功效迄今未見(jiàn)報(bào)道。該研究組[55]利用表觀遺傳改良劑軟木肟酸處理另一個(gè)蟲(chóng)草菌C. annullata獲得5個(gè)新聚酮類(lèi)化合物annullatin A(C17H24O3,圖5), B(C17H26O3,圖5), C(C17H26O4,圖5), D(C17H22O4,圖5)和E(C12H8O3,圖5),有趣的是它們具有類(lèi)似四氫大麻酚結(jié)構(gòu),進(jìn)一步的活性檢測(cè)提示,annullatin A對(duì)大麻素受體1(CB1)和2(CB2)均有明顯的拮抗活性,annullatin B是CB1的選擇性拮抗劑,annullatin D則對(duì)CB2有逆拮抗活性。另外,同時(shí)加入不同類(lèi)型的表觀遺傳改良劑對(duì)蟲(chóng)草菌的次生代謝產(chǎn)物合成有什么影響呢?為此他們?cè)谙x(chóng)草菌Isaria tenuipes 生長(zhǎng)過(guò)程同時(shí)加入組蛋白脫乙?;敢种苿┸浤倦克岷虳NA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑RG-108,結(jié)果顯示其極大地提高了次生代謝產(chǎn)物合成效率,并獲得一種新骨架聚酮類(lèi)化合物tenuipyrone(見(jiàn)圖5)[56]。

    圖5 蟲(chóng)草菌的聚酮類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)圖

    1.6 其它次生代謝產(chǎn)物 蟲(chóng)草菌能代謝合成具有特定功能的天然萘醌、萘酚類(lèi)次生代謝產(chǎn)物。Kittakoop等(1999)自單側(cè)生蟲(chóng)草C. unilateralis獲得6個(gè)萘醌類(lèi)化合物,erythrostominone、deoxyerythrostominone、4-O-methyl erythro- stominone、epierythrostominol、deoxyerythrostominol和3,5,8-三羥基-6-甲氧基-2-(5-氧代-1,3-己二烯)-1,4-萘醌(見(jiàn)圖6),均有抗瘧原蟲(chóng)活性,且前5個(gè)化合物乳腺癌BC、鼻咽癌KB等腫瘤細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒效應(yīng),特別是對(duì)BC細(xì)胞成效顯著。Isaka等[57]在擬蛹蟲(chóng)草C. pseudomilitaris 分離到11個(gè)聯(lián)萘酚類(lèi)(bioxanthracene)化合物(見(jiàn)圖6化合物1-11),其中化合物1-10均具有較強(qiáng)的抗瘧原蟲(chóng)活性,其IC50值在1.1~8.4μg/mL范圍,化合物6、7和8對(duì)BC和KB癌細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒活性。此外,他們還在擬蛹蟲(chóng)草菌中分離到cordyanhydrides A(C20H22O8)和B(C29H32O11),兩個(gè)含2~3個(gè)馬來(lái)酸酐的鏈烯酸(見(jiàn)圖6)[58]。天然產(chǎn)物中帶酸酐的化合物很罕見(jiàn),雖然未見(jiàn)進(jìn)一步活性評(píng)價(jià),但這些稀有的天然產(chǎn)物也許為創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供了更多的選擇。

    圖6 蟲(chóng)草菌的萘醌、酚類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)圖

    圖7 蟲(chóng)草菌的有機(jī)酸、芳香醚等化合物結(jié)構(gòu)圖

    蟲(chóng)草菌還能代謝合成有特殊結(jié)構(gòu)與活性的有機(jī)酸、芳香醚、大環(huán)內(nèi)酯等化合物。Watanabe等[59]在蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)液中分離獲得具有殺蟲(chóng)作用的吡啶二羧酸(見(jiàn)圖7),可作為酚氧化酶原激活的抑制劑。更令人感到振奮的是,在辛萊克蟲(chóng)草C. sinclairii發(fā)酵液分離到(2S,3R,4R)-(E) -2-氨基-3,4-二羥基-2-(羥甲基)-14-氧代-6-二十烯酸(圖7),亦稱(chēng)多球殼菌素(myriocin)或ISP-I。該化合物具有顯著的免疫抑制潛力,F(xiàn)ujita等 (1994) 觀察到其抑制T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞增殖的能力是臨床一線(xiàn)藥物環(huán)孢菌素的10~100倍,與另一種免疫抑制藥物FK-506相當(dāng)。但是,其作用機(jī)制有別于環(huán)孢菌素和FK-506。譬如,Miyake 等(1995)發(fā)現(xiàn)myriocin是通過(guò)降低CTLL-2細(xì)胞(IL-2依賴(lài)的鼠細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞系)中的絲氨酸軟脂酰轉(zhuǎn)移酶活性,抑制其分泌能誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞生IL-2因子,而環(huán)孢菌素和FK-506卻能促使CTLL-2生成IL-2。值得提出的是,myriocin活性強(qiáng),結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單,成藥性高,具有巨大的創(chuàng)制免疫抑制藥物潛力,而替代易引起腎功能衰竭的臨床一線(xiàn)藥物環(huán)孢菌素和FK-506。更有趣的是,F(xiàn)ujita等 (1996) 發(fā)現(xiàn)2-烷基-2-氨基丙烷-1,3-二醇是myriocin的有效部位,為該類(lèi)藥物篩選及化學(xué)合成提供了寶貴信息。最近,Krasnoff等[35]在異足蛛蟲(chóng)草發(fā)酵產(chǎn)物中也分離到myriocin,還發(fā)現(xiàn)其有抗菌作用。因此,蟲(chóng)草資源是新藥創(chuàng)制寶貴資源。

    近來(lái),Varughese等[60]從雙翅目蟲(chóng)草C. dipterigena Berk.& Br中獲得兩個(gè)新的縮酚酸環(huán)醚類(lèi)次生代謝物,cordycepsidone A (C18H12O8,圖7)和B (C18H12O9,圖7),cordycepsidone A中芳香A環(huán)上的甲醛基發(fā)生氧化后生成B,也致使其選擇性抗植物病原真菌活性顯著減弱。Bunyapaiboonsri等[61]在一個(gè)未定名的蟲(chóng)草菌株Cordyceps sp. BCC 1861中發(fā)現(xiàn)6個(gè)二苯醚類(lèi)化合物,其中3個(gè)新化合物命名為cordyols A(C21H26O8,圖7),B(C23H28O10,圖7)和C(C14H14O4,圖7),另3個(gè)已知化合物分別是diorcinol,violaceol-I和violaceol-II。有趣的是cordyol C具有顯著的抗單純皰疹病毒活性(IC50=1.3μg/mL),并對(duì)乳腺癌BC細(xì)胞核肺癌NCI-H187細(xì)胞具有中等細(xì)胞毒活性。violaceol-I和violaceol-II也呈現(xiàn)中等抗癌細(xì)胞毒活性,且有抗瘧原蟲(chóng)活性。除cordyol B外,其它幾個(gè)化合物還有一定的抗結(jié)核桿菌活性。另外,有些蟲(chóng)草菌也產(chǎn)大環(huán)內(nèi)酯天然產(chǎn)物。Rukachaisirikul研究組[62]在蛹蟲(chóng)草中發(fā)現(xiàn)4個(gè)抗瘧原蟲(chóng)活性的大環(huán)內(nèi)酯內(nèi)化合物,化合物1~3(圖7)是新化合物,化合物4為已知化合物cepharosporolide C。另外還分離得到cepharosporolide E、cepharosporolide F和2-羧甲基-4-(3’-丁羥基)呋喃等3個(gè)已知化合物。

    2 蟲(chóng)草資源深度開(kāi)發(fā)利用的發(fā)展方向

    近20多年來(lái),人們一直致力于冬蟲(chóng)夏草替代品的研究,一方面是冬蟲(chóng)夏草菌的發(fā)酵生產(chǎn);另一方面,蟲(chóng)草新資源的發(fā)掘。令人欣慰的是目前已證明巴西蟲(chóng)草C. brasilensis P. Henn.、九州蟲(chóng)草、高雄山蟲(chóng)草、日本蟲(chóng)草、粉被蟲(chóng)草、古尼蟲(chóng)草、香棒蟲(chóng)草C. barnesii Thwaites ex Berk. & Br.、甘肅蟲(chóng)草C. gansuensis Zhang ,Wang & Yan、蛾蛹草C. polyarthra Mêll.、涼山蟲(chóng)草、廣東蟲(chóng)草C. guangdongensis等均為可利用的替代資源。但同樣尚未解決人工規(guī)模培植關(guān)鍵技術(shù),而天然野生資源的種群數(shù)量不可能滿(mǎn)足產(chǎn)業(yè)發(fā)展要求。因此,要實(shí)現(xiàn)可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用蟲(chóng)草資源,必需在與蟲(chóng)草相關(guān)的生物學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)等上游技術(shù)以及規(guī)?;l(fā)酵制備下游技術(shù)等方面取得突破,才是正確的選擇。主要包括以下幾方面:

    2.1 蟲(chóng)草原料制備 蟲(chóng)草野生資源存在原料的數(shù)量不足、原料的質(zhì)量不穩(wěn)定以及破壞生態(tài)環(huán)境、甚至物種資源枯竭等諸多弊端。而絕大多數(shù)蟲(chóng)草的人工培植擴(kuò)繁技術(shù)迄今尚未攻克。因此,規(guī)?;l(fā)酵制備提供了便捷途徑。當(dāng)然,蟲(chóng)草的發(fā)酵也存在許多待解決的問(wèn)題,譬如,菌種分離難、保藏難、生長(zhǎng)慢、難培養(yǎng)等系列生物學(xué)問(wèn)題。不過(guò),這些相比人工規(guī)模培植所涉及的分化問(wèn)題更易獲得突破。譬如冬蟲(chóng)夏草菌的低溫發(fā)酵技術(shù)已取得良好進(jìn)展,且已上市。

    2.2 蟲(chóng)草制品亟待轉(zhuǎn)型升級(jí) 當(dāng)前,無(wú)論是蟲(chóng)草還是其培養(yǎng)物,蟲(chóng)草制品主要是一次性直接利用的生藥或粗制品,產(chǎn)品的技術(shù)含量和附加值低。因此,蟲(chóng)草產(chǎn)品在國(guó)際生物醫(yī)藥市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力弱,蟲(chóng)草原料的深加工刻不容。從長(zhǎng)遠(yuǎn)看,更應(yīng)該注重蟲(chóng)草產(chǎn)品內(nèi)涵的提升,有更好更明確的功效,才會(huì)獲得消費(fèi)者持久的青睞。從本文評(píng)述的蟲(chóng)草多樣的次生活性代謝產(chǎn)物進(jìn)展看,蟲(chóng)草功效歸因于其豐富多樣的天然產(chǎn)物。同時(shí)我們也應(yīng)關(guān)注到,這些次生代謝產(chǎn)物在蟲(chóng)草菌中含量極低,深刻影響到其品質(zhì)。因此,可以采用合適的生物技術(shù)手段和發(fā)酵策略,把蟲(chóng)草發(fā)酵與特定活性物質(zhì)的生物代謝合成調(diào)控相結(jié)合,著眼于高技術(shù)高附加值二次性活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用。

    2.3 蟲(chóng)草新資源次生代謝產(chǎn)物庫(kù)的建立及藥效學(xué)評(píng)價(jià) 我國(guó)蟲(chóng)草的研究工作多集中在冬蟲(chóng)夏草、蛹蟲(chóng)草和蟬花等少數(shù)幾種常見(jiàn)蟲(chóng)草,研究工作相對(duì)較深入。而對(duì)蟲(chóng)草新資源缺乏深入全面系統(tǒng)的研究。就物種本身而言,蟲(chóng)草菌在侵入寄主過(guò)程及定殖前為克服寄主天然的屏障,決定了其次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)域生物活性的多樣性,這些次生代謝產(chǎn)物是新藥創(chuàng)制的突破點(diǎn)。然而,一個(gè)不容忽視的問(wèn)題是,在常態(tài)下,許多蟲(chóng)草的特殊代謝途徑并不啟用,或者說(shuō)調(diào)節(jié)特殊功能次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶和基因處于沉默狀態(tài),故常規(guī)的培養(yǎng)方式影響對(duì)其次生代謝產(chǎn)物庫(kù)的發(fā)掘。因此,我們?cè)谘芯科浯x產(chǎn)物庫(kù)時(shí),既要考慮不同蟲(chóng)草物種間的差別,更要考慮同一物種不同環(huán)境條件下存在代謝途徑的巨大差異。而在外界干預(yù)的特殊環(huán)境下,可能是發(fā)掘蟲(chóng)草資源開(kāi)發(fā)利用潛力的有效途徑。在系統(tǒng)研究蟲(chóng)草新資源次生代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)上,建立天然產(chǎn)物化合物庫(kù),并積極開(kāi)展活性評(píng)價(jià)、作用機(jī)制及成藥性研究,為蟲(chóng)草資源的深度開(kāi)發(fā)利奠定基礎(chǔ)。

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