阿奇霉素對斑馬魚心臟毒性的初步研究

崔國禎，周鶴峰，陳煥嫻，李銘源

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 生物工程系，廣東 珠海 519041;2.澳門大學(xué) 中華醫(yī)藥研究院中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門 999078)

阿奇霉素是第1個(gè)氮雜內(nèi)酯類抗生素，是一較新的廣譜大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。1980年，南斯拉夫藥廠普利瓦(Pliva)成功研發(fā)阿奇霉素，并于1981年獲批上市。美國輝瑞公司(Pfizer)得到全球開發(fā)權(quán)后，將其推向全球市場，使用廣泛。阿奇霉素抗菌譜廣，抗菌活性較好，并具有良好的藥代動力學(xué)特性(半衰期較長，每天僅需服藥1次)，是目前我國臨床抗細(xì)菌感染的主流藥物之一。阿奇霉素在早期的使用過程中，一般認(rèn)為其相對心臟毒副作用小[1]。然而, 近10年來，越來越多的臨床數(shù)據(jù)提示，阿奇霉素有潛在的心臟毒副作用的風(fēng)險(xiǎn)。早期的個(gè)案臨床心臟毒性報(bào)道主要表現(xiàn)為心臟QT間期延長而發(fā)生心律失常，尤其是可發(fā)生尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速的危險(xiǎn)[2]，但未引起醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注。直到2012年，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》刊發(fā)的一項(xiàng)美國臨床研究表明，服用阿奇霉素顯著增加了患者心血管死亡和心臟性猝死的風(fēng)險(xiǎn)[1]，該報(bào)道為阿奇霉素的安全使用敲響了警鐘。鑒于阿奇霉素存在心血管事件的安全隱患，本文主要評價(jià)阿奇霉素對斑馬魚心臟形態(tài)和功能的影響，為抗菌類藥物心臟毒性的作用機(jī)理研究及臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與動物 阿奇霉素粉末購自石家莊歐意藥業(yè)有限公司，野生型和心臟轉(zhuǎn)基因斑馬魚由澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室繁殖。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚胚胎形態(tài)和心率的觀察及評價(jià) 挑選發(fā)育良好的2 d大的斑馬魚胚胎于12孔板，每孔12條，藥物處理分別為：正常對照組和給藥組(0.03、0.1、0.3和1 mm)。為了抑制斑馬魚的黑色素而清楚的觀察斑馬魚的心臟形態(tài)及其功能，將斑馬魚在含有1-苯基-2-硫脲(PTU)的培養(yǎng)液里給藥處理3 d后，將斑馬魚放置于室溫，適應(yīng)環(huán)境溫度15 min以上。在體式顯微鏡觀察下觀察并記錄斑馬魚的心率。將不同處理組的斑馬魚置于玻璃片上，用1%的低熔點(diǎn)瓊脂固定使之固定其呈側(cè)臥狀態(tài)(兩側(cè)眼、體節(jié)重合，尾部與身體處于同一水平面)或正臥狀態(tài)(腹部向下方，身體左右對稱)，用活細(xì)胞工作站系統(tǒng)CELLR(Olympus，日本)連續(xù)拍照片(200張/14 s的速度)。

1.2.2 斑馬魚心搏量的計(jì)算 按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[3 - 4]，采用心搏量(stroke volume)進(jìn)一步評價(jià)斑馬魚心臟的功能。從視屏文件找到心室的舒張期和收縮期圖片(見圖1),測量心室的長軸(用a表示)和短軸(用b表示)，用橢球形的體積公式計(jì)算心室的體積：V=4/3π(a/2)(b/2)2；心搏量的計(jì)算：Stroke volume=V舒張期-V收縮期。

圖1 斑馬魚幼魚心室長軸和短軸長度的測量方法

2 結(jié)果

2.1 阿奇霉素對斑馬魚胚胎心臟形態(tài)及其心率的影響 為了評價(jià)阿奇霉素對斑馬魚胚胎心臟功能的影響，我們首先對斑馬魚胚胎心臟形態(tài)和心率參數(shù)做了觀察。心搏量反應(yīng)心室每收縮1次射出的血液量，是評價(jià)心臟功能的一個(gè)重要指標(biāo)。0.3 mm阿奇霉素對2 d大的斑馬魚胚胎處理3 d后，心包囊水腫形成(見圖2B)，心臟體積變大，心膜出血。由圖2C的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，與正常對照組相比，0.3 mm和1 mm阿奇霉素造模組的心率明顯下降(P< 0.05)。

A:對照組；B:0.3 mm阿奇霉素處理3 d后的斑馬魚心臟部位形態(tài)，箭頭表示心臟部位；C:不同濃度的阿奇霉素對斑馬魚心率的影響；與對照組比較，#P <0.05。圖2 阿奇霉素對斑馬魚心臟形態(tài)和心率的影響

2.2 阿奇霉素對斑馬魚幼魚心搏量的影響 為了進(jìn)一步評價(jià)阿奇霉素對斑馬魚胚胎心臟功能的影響，我們對其心搏量做了計(jì)算統(tǒng)計(jì)。0.3 mm和0.1 mm阿奇霉素對2 d大的斑馬魚胚胎處理3 d后，心臟的心搏量減少(見圖3AB和CD)。由圖3E的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，與對照組相比，0.3 mm和0.1 mm阿奇霉素處理組的心搏量明顯下降(P<0.05)。

A:對照組心室舒張期，箭頭表示斑馬魚的心室; C:對照組心室收縮期；B:0.3 mm阿奇霉素組斑馬魚心室舒張期;D:0.3 mm阿奇霉素組斑馬魚心室收縮期；E:阿奇霉素對斑馬魚胚胎心搏量的影響；與對照組比較，#P <0.05。圖3 阿奇霉素對斑馬魚胚胎心臟功能的影響

3 討論

斑馬魚在發(fā)育早期，身體是透明的，在顯微鏡下可以直觀快速的觀察評價(jià)心臟的功能，是研究心臟功能的理想體內(nèi)模型。斑馬魚的胚胎在受精2 d后，心臟發(fā)育基本成形[5]。0.3 mm和0.1 mm阿奇霉素作用受精2 d的斑馬魚胚胎3 d后，可見其心臟腫大、心膜出血、心率下降、心搏量減少等。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)阿奇霉素對斑馬魚胚胎心臟有一定的毒性作用，與最近臨床阿奇霉素心臟毒性的報(bào)道的結(jié)果相符，故可以用來研究阿奇霉素等抗菌藥物引起的心臟毒性。

心血管疾病嚴(yán)重危害我國人口健康，近幾年因心血管疾病死亡占總死亡原因的41%[6],某些嚴(yán)重心臟毒性已經(jīng)成為人類死亡的原因之一。由于心臟毒性導(dǎo)致開發(fā)藥物失敗和從市場上撤回的事件也屢屢發(fā)生。比如抗菌藥物格帕沙星(Grepafloxacin)于1993年在美國上市，于1999年由于心臟的毒副作用從市場撤出[7]，2007年的羅格列酮心血管安全性爭議[8]。確保藥物無心臟毒副作用，是藥物開發(fā)的重要問題，越來越受到國內(nèi)外相關(guān)研究部門的重視。近日，國外報(bào)道大環(huán)內(nèi)酯類抗生素類阿奇霉素會引起心血管的毒性作用。由阿奇霉素引起的心血管等毒性所導(dǎo)致的死亡風(fēng)險(xiǎn)比阿莫西林高出很多。其中每21 000服用阿奇霉素的病人就有1人由于心血管的毒副作用引起死亡，其引起死亡的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同等條件下的阿莫西林[9]。2013年5月在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》再次發(fā)表了關(guān)于阿奇霉素誘發(fā)心臟毒性的文章。我們回顧分析了從1997年到2010年使用阿奇霉素和未使用該類藥物患者心臟性猝死事件。其中2組是服用和未服用阿奇霉素的樣本量均為1 102 050例。另外2組分別為阿奇霉素和青霉素V給藥，樣本量分別為1 102 419和7 364 292。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未使用阿奇霉素的病例相比，使用5 d療程阿奇霉素相關(guān)的心血管死亡事件明顯升高，發(fā)生率約1.1‰。與青霉素相比，心血管事件的發(fā)生沒有明顯增加[10]。其次，我國對此現(xiàn)象也做了簡單的報(bào)告[11 - 12]。

阿奇霉素引起QT間期延長、誘發(fā)心動過速等心臟毒性的具體機(jī)制不清楚。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素包括紅霉素(靜脈滴注或口服)、克拉霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、螺旋霉素的心臟毒性的作用機(jī)制有一定的報(bào)道。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紅霉素可使豚鼠心肌細(xì)胞動作電位顯著延長，通過抑制鈉鉀離子通道，并特異性地抑制了跨膜鉀電流[13 - 14]，這可能是紅霉素在臨床應(yīng)用誘發(fā)心臟毒性的機(jī)制，特別是心律失常的機(jī)制。阿奇霉素心臟毒性的機(jī)制，可能也與心肌細(xì)胞動作電位和鉀離子電流的調(diào)控有關(guān)系。雖然阿奇霉素抗菌作用廣泛、抗菌活性強(qiáng)，但其心臟的毒副作用，會嚴(yán)重影響其在臨床上使用。目前，還未見采用心臟保護(hù)藥物以減輕抗菌藥物引起的心臟毒性的報(bào)道。因此，闡明阿奇霉素心臟毒性的作用機(jī)理，尋找針對該藥有效的心臟保護(hù)藥物和對阿奇霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步改進(jìn)修飾以達(dá)到減輕心臟毒性是一種可行的研究方向，值得醫(yī)藥工作者去思考研究。其次，由阿奇霉素誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎心臟毒性模型成功的建立，為抗菌類藥物心臟毒性的作用機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

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