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    小葉錦雞兒內(nèi)生拮抗菌株的篩選與分子鑒定

    2014-08-12 13:47:01李志英田岳娟徐惠娟代金霞
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年6期
    關(guān)鍵詞:分子鑒定抑菌活性

    李志英 田岳娟 徐惠娟 代金霞

    摘要:采用抑菌圈法對(duì)分離自寧夏荒漠草原固沙植物小葉錦雞兒的27株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行植物病原菌抑制能力的測(cè)定。結(jié)果表明,小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌的抑菌能力較強(qiáng),多數(shù)菌株對(duì)2種以上的病原菌表現(xiàn)出拮抗活性,且不同菌株之間以及同一菌株對(duì)不同病原菌間的拮抗活性存在很大差異,有7株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)所有供試病原菌都表現(xiàn)出一定的抑制活性。通過16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn),小葉錦雞兒內(nèi)生拮抗菌株分別與芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、羅爾斯通氏菌屬、中華根瘤菌屬具有很高的同源性,這些菌株多數(shù)為芽孢桿菌。

    關(guān)鍵詞:小葉錦雞兒;內(nèi)生菌;抑菌活性;分子鑒定

    中圖分類號(hào): Q939.92文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2014)06-0105-02

    收稿日期:2013-09-04

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):31200103);寧夏自然科學(xué)基金(編號(hào):NZ12152)。

    作者簡(jiǎn)介:李志英(1977—),女,寧夏青銅峽人,博士,講師,研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)。E-mail:lizhiying_1115@163.com。

    通信作者:代金霞,女,寧夏銀川人,博士,副教授,研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物。E-mail:djxia05@163.com。植物內(nèi)生菌(endophyte)是指生長(zhǎng)在健康植物組織、器官內(nèi)部,而又不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物類群[1]。植物內(nèi)生菌長(zhǎng)期生存于植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中并與宿主協(xié)同進(jìn)化,一方面植物體為其提供生長(zhǎng)所必需的能量和營(yíng)養(yǎng),另一方面,內(nèi)生菌又可以通過自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號(hào)傳導(dǎo)作用對(duì)植物體產(chǎn)生影響[2]。許多植物內(nèi)生細(xì)菌具有多方面的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)功能,如固氮、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、抗逆境、抗病蟲害和生物修復(fù)等。

    植物病害是引起植物品質(zhì)下降、產(chǎn)量損失的主要原因之一,約80%的植物病害是由植物病原菌引起的。目前,對(duì)植物病害的主要防治手段是采用化學(xué)農(nóng)藥,而化學(xué)農(nóng)藥對(duì)人畜的副作用以及殘留問題、環(huán)境污染問題已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟需解決的主要問題。植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生眾多的抗菌產(chǎn)物并在一定條件下成為植物病原菌的拮抗菌,卻不會(huì)引起宿主植物明顯的病癥,目前從植物體內(nèi)篩選對(duì)植物病原菌具有抑制作用的拮抗內(nèi)生菌并進(jìn)行生物防治已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[3]。

    小葉錦雞兒(Caragana microphylia Lam.)為豆科蝶形花亞科錦雞兒屬植物,具有廣泛的適應(yīng)性和極強(qiáng)的抗逆性,是中國(guó)西北、華北、東北西部水土保持和固沙造林的重要樹種之一。小葉錦雞兒在維護(hù)干旱荒漠區(qū)的生態(tài)平衡、改善沙區(qū)環(huán)境、發(fā)展畜牧業(yè)生產(chǎn)、提高沙區(qū)的經(jīng)濟(jì)效能中發(fā)揮著十分重要的作用[4]。

    本試驗(yàn)通過對(duì)小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌抑制植物病原菌的能力進(jìn)行測(cè)定,試圖篩選出具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株并對(duì)其進(jìn)行分子鑒定。研究結(jié)果不僅可為開發(fā)生物農(nóng)藥提供菌種資源,同時(shí)也將為豐富我國(guó)的微生物資源、推動(dòng)干旱地區(qū)微生物資源的保護(hù)、開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1供試菌株

    供試菌株分離自寧夏荒漠固沙植物小葉錦雞兒的各部分組織中,根據(jù)培養(yǎng)形態(tài)選取其中的27株進(jìn)行抑菌試驗(yàn),菌種編號(hào)分別為:R05、R09、R10、R12、R14、R18、R41、R43、R44、R46、R47、R48、L01、L02、L05、L10、L12、L13、L15、L16、L17、L18、L19、L20、S01、S03、SD3。指示病原菌為:小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici)、番茄炭疽病菌(Colletotrichum lycopersici)、玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)、馬鈴薯干腐病菌(Fusarium solani)、蘿卜黑斑病菌(Alternaria sp.),均來源于寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理室。

    1.2內(nèi)生菌的分離與純化

    各稱取1 g小葉錦雞兒的根、莖、葉,表面消毒后置于滅菌研缽中研磨;將磨碎的組織加到含有滅菌生理鹽水和滅菌玻璃珠的錐形瓶中,渦旋振蕩1 min;將上清液倒入滅菌離心管中沉淀后,再將上清液進(jìn)行梯度稀釋,稀釋率分別為10-1、10-2、10-3,各取0.1 mL涂LB平板,每個(gè)處理重復(fù)3次;同時(shí)取0.1 mL最后一次沖洗的無菌水涂平板,作為表面滅菌對(duì)照。將所有平板于28 ℃培養(yǎng) 72 h,挑取平板上的單菌落進(jìn)行劃線分離,直至得到純的單菌落并保存在斜面上備用。

    1.3抑菌能力的測(cè)定

    采用LB固體培養(yǎng)基抑菌圈法進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定。用接種環(huán)分別挑取純化好的內(nèi)生菌單菌落接入裝有20 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中,于28 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng) 48 h,取出后用無菌水調(diào)至D值一致。將指示病原菌接入PDA液體培養(yǎng)基中,在28 ℃、100 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h,無菌過濾后取上清備用。

    采用對(duì)峙培養(yǎng)法,取200 μL指示病原菌濾液并用無菌玻璃棒均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上,干燥后用滅菌打孔器對(duì)稱打4個(gè)孔,取35 μL內(nèi)生菌發(fā)酵液滴于孔中,置于 28 ℃ 恒溫培養(yǎng),每處理各3個(gè)重復(fù)。從培養(yǎng)第1天開始觀察菌落生長(zhǎng)情況,并記錄內(nèi)生菌形成的透明圈直徑。抑菌能力通過計(jì)算內(nèi)生菌菌落形成的透明圈直徑與孔直徑的比值(D/d值)來評(píng)價(jià):D/d值越大,抑菌能力越強(qiáng);比值越小,抑菌能力越弱;比值為1時(shí)表示菌落無抑菌能力。

    1.4菌株的分子鑒定

    將篩選出的具有較強(qiáng)抑菌能力的菌株進(jìn)行總DNA的提取。采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F、1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增[5]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行16S rDNA全序列的測(cè)定,將所測(cè)序列在GenBank中進(jìn)行BLAST同源性搜索,以確定菌株的分類地位。

    2結(jié)果與分析

    2.1小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌的抑菌活性

    ,分離的27株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)供試病原菌的抑菌能力差別較大,有6株內(nèi)生菌對(duì)供試的所有病原菌均未表現(xiàn)出抑菌活性,而多數(shù)菌株對(duì)2種以上的病原菌表現(xiàn)出抑制活性。此外,同一菌株對(duì)不同病原菌的抑制能力也存在很大差異,如R10對(duì)番茄枯萎病菌和番茄炭疽病菌的抑制能力很強(qiáng),但對(duì)蘿卜黑斑病菌卻無抑菌活性;L17、R18對(duì)蘿卜黑斑病菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制活性,但對(duì)番茄炭疽病菌的抑菌活性卻很低。從整體上看,小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌的抑菌能力較強(qiáng),R43、L01、L02、L05、L16、L20、S03等7株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)所有供試病原菌都表現(xiàn)出一定的抑制活性。

    2.2內(nèi)生細(xì)菌的鑒定結(jié)果

    將篩選出的具有較強(qiáng)抑菌活性的內(nèi)生菌16S rDNA序列與GenBank中的同源序列進(jìn)行比較,結(jié)果表明,這些菌株分別與芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobum)的細(xì)菌具有很高的同源性(表2),且多數(shù)菌株隸屬于芽孢桿菌屬。

    小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌抑菌能力的測(cè)定結(jié)果

    菌種

    編號(hào)透明圈直徑/孔直徑(D/d值)番茄枯

    萎病菌番茄炭

    疽病菌玉米大

    斑病菌小麥赤

    霉病菌馬鈴薯干

    腐病菌蘿卜黑

    斑病菌R051.381.001.002.761.001.28R091.001.002.951.731.001.50R103.864.672.572.812.381.00R121.001.001.001.001.001.00R143.122.241.003.571.002.38R182.151.001.002.242.278.39R411.001.001.001.001.001.00R432.672.052.335.052.675.67R441.001.001.002.111.004.00R461.001.001.001.001.001.00R473.141.003.103.332.093.00R481.001.001.001.712.544.95L012.382.091.714.002.626.15L022.131.672.003.252.237.17L053.574.333.812.332.221.91L101.001.001.001.001.001.00L121.001.001.001.001.001.00L131.731.001.002.832.257.22L152.252.452.001.002.501.00L162.722.362.954.252.22 6.92L171.731.002.113.381.959.43L181.001.001.001.001.001.00L192.273.763.142.382.181.00L202.352.763.336.002.188.33S013.674.572.763.051.821.00S033.194.383.713.482.582.50SD33.144.483.522.482.271.00

    內(nèi)生菌的16S rDNA的鑒定結(jié)果

    菌株NCBI比對(duì)結(jié)果序列相似性

    (%)R43,L01,L16Bacillus cereus100Bacillus thuringiensis100Bacillus subtilis100L19,R18Bacillus pumilus100L17Bacillus simplex100R10 Bacillus idriensis100R14,R47Paenibacillus ehimensis99S01Pseudomonas syringae97L02,L05,L20 Ralstonia pickettii100S03Sinorhizobum melioti100

    3結(jié)論

    植物體可以看作是被許多不同細(xì)菌開發(fā)的不同生境的復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)。在植物微生態(tài)系統(tǒng)中,不同的內(nèi)生菌可以占據(jù)不同的生態(tài)位,它們相互作用并在植物體內(nèi)維持著微生態(tài)平衡。植物內(nèi)生菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度,又有廣泛的應(yīng)用潛力,是個(gè)潛力巨大、尚待開發(fā)的微生物新資源。本研究運(yùn)用抑菌圈法對(duì)小葉錦雞兒內(nèi)生細(xì)菌拮抗植物病原菌的能力進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果表明, 多數(shù)菌株對(duì)不同的病原菌均表現(xiàn)出一定的抑制能力。經(jīng)16S rDNA序列分析表明,多數(shù)具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株隸屬于芽孢桿菌屬。

    據(jù)報(bào)道,芽孢桿菌屬的一些種類對(duì)外界有害因子的抵抗力強(qiáng),菌體生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的枯草菌素、制霉菌素等多種活性物質(zhì)對(duì)植物病原菌有明顯的抑制作用[6]。蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis由于能產(chǎn)生δ內(nèi)毒素,對(duì)鱗翅目等昆蟲的幼蟲有毒殺作用而被用以制造生物農(nóng)藥,是常用的生防資源菌[7]。芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、類芽孢桿菌屬的許多菌株不僅可以分泌吲哚乙酸或赤霉素等,從而有效促進(jìn)植物的生長(zhǎng),而且能抑制多種病原菌的活性,從而顯著提高植物的抗病性。

    作為防風(fēng)固沙的先鋒物種,小葉錦雞兒的生態(tài)學(xué)意義遠(yuǎn)大于其經(jīng)濟(jì)學(xué)意義,發(fā)掘與其共生的微生物資源不僅對(duì)探索極端環(huán)境中內(nèi)生細(xì)菌-宿主植物的協(xié)同進(jìn)化研究有著重要的指導(dǎo)意義,而且有助于我們更加透徹地認(rèn)識(shí)其共生體系的形成及抗逆機(jī)理。期待能夠從研究中找到增強(qiáng)小葉錦雞兒抗逆性的合適途徑,進(jìn)而對(duì)沙漠化的治理起到積極的作用。

    參考文獻(xiàn):

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    [2]Kiers E T,Denison R F. Sanctions,cooperation,and the stability of plant-rhizosphere mutualisms[J]. Annual Review of Ecology,Evolution,and Systematics,2008,39:215-236.

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