青蒿素對實驗性糖尿病大鼠腎臟PDGF-B表達(dá)上調(diào)的影響

張麗坤，蘇彥君，周鳳嬌，張建勇，安志霞

(河北省石家莊市第二醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

青蒿素對實驗性糖尿病大鼠腎臟PDGF-B表達(dá)上調(diào)的影響

張麗坤，蘇彥君，周鳳嬌，張建勇，安志霞

(河北省石家莊市第二醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

目的 探討青蒿素對實驗性糖尿病大鼠腎臟血小板衍化生長因子-B(PDGF-B)表達(dá)上調(diào)的抑制作用。方法 將36只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(A組)、糖尿病非治療組(B組)及糖尿病青蒿素治療組(C組),B、C組采用腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素(STZ)65 mg/kg建立糖尿病大鼠模型。C組給予青蒿素300 g/(kg·d)腹腔注射。于實驗第3周、第6周各組分別宰殺6只大鼠，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測腎皮質(zhì)PDGF-B的蛋白表達(dá)。并檢測肌酐清除率(Ccr)、 24 h尿白蛋白排泄率(UAER)及腎質(zhì)量/體質(zhì)量。腎組織制備電子顯微鏡切片以觀察腎組織超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果 C組大鼠腎質(zhì)量/體質(zhì)量、Ccr、UAER均顯著低于B組(P<0.05或0.01)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)B組大鼠腎組織PDGF-B表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，C組表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。電鏡示B組大鼠腎臟病變廣泛，腎小球系膜細(xì)胞增生，系膜區(qū)增寬，基底膜增厚，臟層細(xì)胞肥大。C組大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)異常顯著減輕。結(jié)論 青蒿素能減輕糖尿病大鼠腎臟病變，主要通過下調(diào)糖尿病大鼠腎組織PDGF-B表達(dá)來實現(xiàn)。

糖尿病腎??；青蒿素；血小板衍化生長因子-B；免疫組織化學(xué)

近年來，糖尿病發(fā)病率在全球迅速上升，使糖尿病腎病發(fā)病率逐年增加，目前在發(fā)達(dá)國家糖尿病腎病已成為引起終末期腎衰竭(ESRD)的首要原因。而腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在其中的作用引起廣泛關(guān)注。血管緊張素Ⅱ除了具有調(diào)節(jié)全身和腎血流動力學(xué)效應(yīng)外，尚有一系列非血流動力學(xué)效應(yīng)導(dǎo)致腎臟功能受損，如誘導(dǎo)腎內(nèi)多種細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，包括血小板源性生長因子(PDGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)。PDGF介導(dǎo)腎臟細(xì)胞的增生肥大及細(xì)胞外基質(zhì)合成增多。其中PDGF-B在其中起重要作用[1]。青蒿素是從青蒿葉中分離的抗瘧有效成分，近年來發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等。而細(xì)胞周期調(diào)節(jié)異常與糖尿病腎病發(fā)病密切相關(guān)。本實驗通過觀察青蒿素對糖尿病大鼠腎組織PDGF-B表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，為臨床探尋防治糖尿病腎病提供新的視角。

1 實驗資料

1.1 實驗動物與分組 雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g(購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物部)，隨機(jī)分為3組，即正常對照組(A組)、糖尿病非治療組(B組)及糖尿病青蒿素治療組(C組)，每組12只。

1.2 模型制備 大鼠腹腔單劑量注射STZ(購自Sigma公司)65 mg/kg，對照組僅腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。72 h后經(jīng)尾靜脈采血，使用達(dá)優(yōu)血糖儀(廣州達(dá)優(yōu)醫(yī)療設(shè)備有限公司)測全血血糖，血糖≥16.7 mmol/L確定為糖尿病大鼠。

1.3 動物給藥 青蒿素(購自成都偉輝生物科技有限公司)溶于二甲基亞砜(DMSO)中，自造模當(dāng)天起C組大鼠腹腔注射青蒿素300 mg/(kg·d)，A組與B組分別給予等量二甲基亞砜腹腔注射。所有大鼠自由進(jìn)食、飲水，不用任何降糖藥物。在實驗進(jìn)行到第3周、第6周時各組分別宰殺6只大鼠。

1.4 標(biāo)本收集 所有大鼠宰殺前1 d收集24 h尿液，分別取6 mL，監(jiān)測尿肌酐、UAER。大鼠稱質(zhì)量，取血5 mL，測定血肌酐、尿素氮及血糖。雙腎稱質(zhì)量，少量右腎腎皮質(zhì)用3%戊二醛溶液浸泡固定，備電鏡觀察。用10%中性甲醛溶液浸泡固定部分右腎皮質(zhì)，以備免疫組織化學(xué)染色。

1.5 生化指標(biāo)檢測 用放射免疫法檢測大鼠尿白蛋白。生化指標(biāo)檢測采用日產(chǎn)奧林巴斯AU400自動生化分析儀，計算肌酐清除率(Ccr)，結(jié)果需用體質(zhì)量校正。

1.6 免疫組化染色 免疫組化染色應(yīng)用SP方法。其中，用1% BSA代替一抗作陰性對照。采用病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析染色結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 各組生化指標(biāo)比較 B、C組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素72 h后血糖≥16.7 mmol/L,說明糖尿病模型成功。同期相比，B組大鼠顯著低于A組(P<0.05)，并呈進(jìn)行性下降，而腎質(zhì)量及腎質(zhì)量/體質(zhì)量值均逐漸增加，與A組相比有顯著性差異(P均<0.05)。C組體質(zhì)量均高于B組(P<0.05)，腎質(zhì)量、腎質(zhì)量/體質(zhì)量值均顯著低于B組(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠UAER及腎功能比較 造模后B組大鼠血UAER及尿素氮明顯高于A組大鼠(P<0.05或0.01)。而C組大鼠血UAER、尿素氮及Ccr均低于同期B組(P<0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠PDGF-B蛋白在腎皮質(zhì)表達(dá)結(jié)果比較 A組大鼠PDGF-B蛋白主要在腎集合管、近段小管及遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞細(xì)胞漿表達(dá)，系膜細(xì)胞表達(dá)量極少，實驗3周與6周相比其表達(dá)無變化。同期相比，B組大鼠上述部位PDGF-B表達(dá)較A組大鼠均明顯增加(P<0.01)。而C組大鼠上述部位PDGF-B的表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05或0.01)，但在第6周時均明顯高于對照組大鼠(P<0.01)。見表3。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、腎質(zhì)量、腎質(zhì)量/體質(zhì)量及血糖比較

注：①與A組比較，P<0.05;②與A組比較,P<0.01;③與B組比較，P<0.05。

表2 各組大鼠生化指標(biāo)及UAER的比較

注：①與A組比較，P<0.05;②與A組比較，P<0.01;③與B組比較，P<0.05。

表3 各組大鼠腎皮質(zhì)表達(dá)PDGF-B蛋白比較%)

注：①與A組比較，P<0.05;②與A組比較，P<0.01;③與B組比較，P<0.05;④與B組比較，P<0.01。

2.4 各組大鼠腎組織電鏡結(jié)果觀察 電鏡結(jié)果表明，對照組大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)在第3周、第6周均未見異常病理學(xué)變化；與A組大鼠相比，可發(fā)現(xiàn)B組大鼠腎臟病變廣泛，呈進(jìn)行性、彌漫性分布。B組大鼠腎小球臟層上皮細(xì)胞肥大，足突部分融合，基底膜不規(guī)則增厚，內(nèi)皮細(xì)胞窗空消失或融合。腎小球系膜細(xì)胞增生，系膜區(qū)增寬，系膜基質(zhì)增多。而C組大鼠與B組大鼠腎組織同期比較，上述部位病變減輕明顯。

3 討 論

作為一種重要的多肽類生長因子PDGF由內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞等產(chǎn)生。在腎小球疾病中，PDGF的靶細(xì)胞主要為系膜細(xì)胞，它與細(xì)胞增生、分泌細(xì)胞外基質(zhì)密切相關(guān)，參與腎小球疾病的發(fā)生、發(fā)展[2-4]。

研究表明，PDGF-B廣泛參與了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。在高糖環(huán)境中培養(yǎng)的系膜細(xì)胞及糖尿病大鼠的腎小球，PDGF-B和其受體PDGFR-β表達(dá)上調(diào)，而PDGF-B是一種強(qiáng)烈的有絲分裂原刺激物，與糖尿病早期腎細(xì)胞的有絲分裂密切相關(guān)。并可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β，導(dǎo)致細(xì)胞肥大，引起膠原產(chǎn)生增加，細(xì)胞外基質(zhì)堆積[5-6]。

本研究所采用的糖尿病大鼠模型已出現(xiàn)早期糖尿病腎病的病理學(xué)改變，如腎小球系膜區(qū)增大，基質(zhì)堆積，系膜細(xì)胞增生，基底膜增厚。分別在第3周、第6周腎質(zhì)量/體質(zhì)量值、腎質(zhì)量、UAER及Ccr逐漸升高。

本實驗應(yīng)用免疫組化染色觀察到PDGF-B蛋白在糖尿病大鼠腎組織細(xì)胞漿，如系膜細(xì)胞、近段及遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞及集合管細(xì)胞的胞漿表達(dá)均明顯上調(diào)，糖尿病大鼠腹腔注射青蒿素300 mg/(kg·d)在實驗進(jìn)行到第3周、第6周時，均可觀察到PDGF-B在大鼠腎臟上述部位的表達(dá)受到明顯抑制，并有效減輕腎皮質(zhì)損傷。通過電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)，可發(fā)現(xiàn)青蒿素治療組大鼠與非治療組大鼠比較，治療組大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生減輕，基底膜增厚改善，細(xì)胞外基質(zhì)減少。青蒿素有效改善了糖尿病大鼠腎小球超微結(jié)構(gòu)損傷。而這一腎臟保護(hù)作用與代謝因素?zé)o關(guān)，因為糖尿病非治療鼠組與青蒿素治療組大鼠血糖水平無明顯差異。

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Effect of Artemisinin on the upregulation of PDGF-B protein expression in the kidney of experimental diabetic rats

Zhang Likun, Su Yanjun, Zhou Fengjiao, Zhang Jianyong, An Zhixia

(The Second Hospital of Shijiazhuang City, Shijiazhuang 050051, Hebei, China)

Objective It is to investigate the inhibitory effect of artemisinin on the upregulation of PDGF-B protein expression in the kidney of experimental diabetic rats. Methods 36 male SD rats were randomly divided into normal control group(A group), non-treatment diabetic group(B group), and diabetic treated with Artemisinin group(C group). The diabetic models of rats were established by STZ 65 mg/kg by intraperitoneal injection in group B and group C. Group C was given Artemisinin 300 g/(kg·d) by intraperitoneal injection. UAER, Ccr as well as the profile of kidney hypertrophy were observed after 3, 6 weeks of treatment, while PDGF-B protein expression was measured by immunohistological staining. In addition, renal tissues were observed by transmission electron microscopy. Results Kidney/body weight ratio, Ccr, and UAER of the rats in group C were significantly lower than those in group B (P<0.05 or 0.01). Immumohistochemical staining results showed that the protein expression of PDGF-B(P<0.01) significantly increased in renal tissue in group B(P<0.01), while decreased in group C(P<0.01). Electron microscopy results showed that in the rats of group B, extensive kidney lesion, glomerular mesangial cell proliferation and mesangial area broadening, thickening of basement membrane, dirty layer cell hypertrophy were found, while in groupC, abnormal ultrastructure was significantly relieved. Conclusion Atemisinin can relieve renal lesions in experimental diabetic rats, which was partly through inhibiting PDGF-B expression in renal cortices.

Atemisinin; diabetic nephropathy; platelet-derived growth factor-B; immunohistological staining

張麗坤，女，主治醫(yī)師，研究方向為糖尿病腎病及血液透析。

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.13.009

R-332

A

1008-8849(2014)13-1392-03

2014-01-10