延遲亞低溫治療對(duì)大鼠腦出血后出血灶周圍水腫形成的影響

趙軍蒼，劉曉紅，蘇鈺清，楊華堂，王獻(xiàn)明

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

延遲亞低溫治療對(duì)大鼠腦出血后出血灶周圍水腫形成的影響

趙軍蒼，劉曉紅，蘇鈺清，楊華堂，王獻(xiàn)明

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

目的 評(píng)估延遲腦低溫(BH)(35 ℃)對(duì)腦出血(ICH)48 h后腦水腫形成的影響。方法 將Sprague-Dawley大鼠分為亞低溫組(HT組)及常溫組(NT組)，將100 μL大鼠自體血注入基底節(jié)誘導(dǎo)ICH。HT組ICH發(fā)生后3,6,12,24 h分別進(jìn)行亞低溫處理，分別作為HT3、HT6、HT12、HT24組。檢測(cè)比較各組ICH后48 h腦組織含水量。比較NT組(37 ℃，n=7)及HT6組血腦屏障通透性、DNA氧化損傷及行為學(xué)缺損評(píng)分的差異。結(jié)果 單側(cè)基底節(jié)區(qū)腦組織水含量各亞低溫組均明顯少于NT組(P均<0.01)。與NT組相比，HT6組單側(cè)基底節(jié)血腦屏障破壞明顯減少(P<0.05)。在接受BH處理的大鼠中，提取出血側(cè)半球DNA的8-OHdG水平明顯低于NT組(P<0.05)。此外，ICH后48 h， HT6組大鼠前肢放置試驗(yàn)評(píng)分明顯優(yōu)于NT組(P<0.05)。結(jié)論 延遲BH治療能夠顯著減輕ICH后的腦水腫。BH主要通過(guò)減輕血腦屏障功能損害、減輕炎性反應(yīng)、減輕DNA的氧化應(yīng)激損傷實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)功能。

腦水腫；腦部低溫；腦出血；氧化應(yīng)激損傷

自發(fā)性顱內(nèi)出血(ICH)致死率高達(dá)30%～40%，占急性腦卒中的20%～30%，患者的神經(jīng)功能缺損情況通常也比較嚴(yán)重[1]。在ICH發(fā)病后，由于血腫的占位效應(yīng)及血腫引起的一系列炎癥反應(yīng)，腦組織將受到明顯損傷，繼發(fā)性的腦水腫形成進(jìn)一步導(dǎo)致腦組織損傷及細(xì)胞死亡[2]。MacLellan等[3]指出將自體血液注射至大鼠紋狀體產(chǎn)生ICH后1～4 h開(kāi)始進(jìn)行亞低溫治療，能夠減少腦水腫形成及血腦屏障的紊亂，減少炎性細(xì)胞的滲透。目前亞低溫治療多在患者發(fā)病12 h內(nèi)進(jìn)行，能夠減少ICH的繼發(fā)性損傷，如腦水腫、血腦屏障損害、炎癥及出血灶周圍的氧化應(yīng)激損傷。因?yàn)檠[周圍組織損傷自ICH發(fā)生后逐漸進(jìn)展，故本研究探討了ICH后延遲的亞低溫治療(ICH發(fā)病超過(guò)12 h)對(duì)腦水腫形成、血腦屏障的通透性、炎性反應(yīng)、DNA氧化應(yīng)激性損傷及大鼠行為學(xué)損傷的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 動(dòng)物準(zhǔn)備及顱內(nèi)血液注射 選擇250～400 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠34只，腹膜內(nèi)注射苯巴比妥鈉(60 mg/kg)進(jìn)行麻醉。使用PE-50導(dǎo)管插入股動(dòng)脈以檢測(cè)動(dòng)脈壓及獲得研究血?dú)狻H、血細(xì)胞密度及血糖的動(dòng)脈血。手術(shù)期間將大鼠體溫維持在37 ℃。在左側(cè)冠狀縫距離中線3 mm處進(jìn)行無(wú)菌鉆孔，在立體導(dǎo)向的指引下，將鈍的計(jì)量注射針插入左側(cè)基底節(jié)。再使用微注射泵將100 μL大鼠自體全血以20 μL/min速率注入。自體血注入完成后，快速拔出針并在鉆孔周圍涂抹氰基丙烯酸酯粘合劑，縫合皮膚切口。術(shù)后將大鼠隨機(jī)分為常溫組(NT組,n=7)及亞低溫組(HT組)。將NT組大鼠放置于溫度保持在25 ℃的養(yǎng)育箱中48 h，HT組大鼠放置于溫度保持在5 ℃的養(yǎng)育箱中，ICH誘導(dǎo)后3,6,12,24 h進(jìn)行亞低溫處理,分別作為HT3組(n=4)、HT6組(n=6)、HT12組(n=12)、HT24組(n=24)。將針樣遙感測(cè)溫探針插入冠狀縫6 mm深處測(cè)量置于25 ℃及5 ℃養(yǎng)育箱中大鼠的腦部溫度，監(jiān)測(cè)48 h。

1.2 大腦水含量的測(cè)量 ICH 48 h后，使用苯巴比妥對(duì)大鼠進(jìn)行深度麻醉，斷頭處死大鼠?？焖偃コX組織，從距離額極3 mm處切2個(gè)厚度為3 mm的切片。前片(A片)包含位于基底節(jié)區(qū)的穿刺針的軌跡及動(dòng)脈血注射點(diǎn)，相鄰的一片(B片)是動(dòng)脈血注射點(diǎn)后方的部分。沿正中線將腦切片分為左右半球兩部分，將每側(cè)皮質(zhì)與基底節(jié)區(qū)分離，將位于基底節(jié)的血腫與周圍組織分離。記錄樣品組織的濕質(zhì)量(WW)，精確到0.1 mg。之后將樣品組織烘干測(cè)量干質(zhì)量(DW)。公式(WW-DW)/WW×100%用于計(jì)算大腦水含量。

1.3 血腦屏障通透性 使用伊文思藍(lán)(EB)測(cè)量血腦屏障的完整性。在誘導(dǎo)ICH 48 h后，將EB溶液靜脈注入大鼠體內(nèi)，30 min后將大鼠使用苯巴比妥鈉麻醉。將胸腔打開(kāi)，經(jīng)左心室以100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的壓力注入200 mL鹽水直到?jīng)]有帶顏色的液體從右心房流出。大鼠斷頭處死后，快速去除腦組織，從距離額極3 mm處切2個(gè)厚度為3 mm的切片。前片(A片)包含位于基底節(jié)區(qū)的穿刺針的軌跡及動(dòng)脈血注射點(diǎn)，相鄰的一片(B片)是動(dòng)脈血注射點(diǎn)后方的部分。沿正中線將腦切片分為左右半球兩部分，將每側(cè)皮質(zhì)與基底節(jié)區(qū)分離，將位于基底節(jié)的血腫與周圍組織分離。稱量樣品質(zhì)量，將其放置于50%三氯乙酸溶液中，勻化并離心后，將離心染液使用乙醇稀釋(1∶3)，使用分光計(jì)進(jìn)行熒光觀察。計(jì)算組織所含EB的量。

1.4 DNA中8-OHdG含量 DNA容易受到氧化應(yīng)激損傷。8-OHdG是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的敏感標(biāo)志物[4]。提取DNA后，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定8-OHdG的水平。

1.5 行為學(xué)測(cè)驗(yàn) 對(duì)所有大鼠進(jìn)行前肢放置試驗(yàn)評(píng)分[5]。

2 結(jié) 果

2.1 大腦的水含量 大腦亞低溫處理可顯著抑制A切片中單側(cè)基底節(jié)區(qū)及皮質(zhì)腦水腫的形成。在臨近A切片的B切片中，大腦亞低溫處理也顯著抑制基底節(jié)區(qū)及皮質(zhì)的腦水腫，在HT各組之間，大腦水含量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1。

2.2 血腦屏障對(duì)EB的通透性 在A切片的單側(cè)基底節(jié)區(qū)，與NT組相比，BH能夠明顯保護(hù)血腦屏障被破壞，但在A切片的單側(cè)皮質(zhì)區(qū)，沒(méi)有觀察到BH的這種效應(yīng)。在臨近B切片的單側(cè)基底節(jié)區(qū)及皮質(zhì)區(qū)，BH能夠明顯保護(hù)血腦屏障被破壞。見(jiàn)表2。

表1 各組單側(cè)基底節(jié)區(qū)及皮質(zhì)大腦的水含量比較%)

注：①與相應(yīng)切片NT組比較，P<0.05。

表2 NT組和HT6組血腦屏障對(duì)EB的通透性

注：①與NT組比較，P<0.05；②與NT組比較，P<0.01。

2.3 DNA中8-OHdG含量 在接受BH處理的大鼠中，提取出血側(cè)半球DNA的8-OHdG水平，HT6組為(41±8)pg/μg，明顯低于NT組的((91±17)pg/μg(P<0.05)。對(duì)側(cè)半球提取DNA的8-OHdG水平2組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 大鼠行為學(xué)評(píng)分 ICH后48 h， HT6組大鼠前肢放置試驗(yàn)評(píng)分明顯優(yōu)于NT組，但是ICH后24 h，2組的前肢放置試驗(yàn)評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 NT組和HT6組大鼠行為學(xué)評(píng)分

注：①與NT組比較，P<0.05。

3 討 論

ICH后腦水腫的機(jī)制到目前為止并不明確[2]。有理論認(rèn)為血腫的占位效應(yīng)壓迫大腦，導(dǎo)致被壓區(qū)域組織微循環(huán)紊亂，缺血缺氧，最終出現(xiàn)血腫周圍腦組織水腫[3]。但是，目前沒(méi)有研究結(jié)果表明血腫的占位效應(yīng)所導(dǎo)致低灌注的程度或持續(xù)時(shí)間足以產(chǎn)生缺血性腦損傷。研究者開(kāi)始把注意力放在從血腫中釋放出的導(dǎo)致腦水腫的生化物質(zhì)上。ICH后腦水腫的形成主要包括2個(gè)時(shí)期：急性期(ICH后2 d)，為凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，血塊形成；亞急性期(ICH后3 d)，為紅細(xì)胞崩解及血紅蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性。血腫能夠破壞血腦屏障的完整性并直接導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡[6]。鐵是血紅蛋白的降解產(chǎn)物，大腦內(nèi)鐵超載會(huì)引起自由基的形成及氧化損傷，如ICH后的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[7]。炎性反應(yīng)包括白細(xì)胞累積及腦實(shí)質(zhì)補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，均在與ICH相關(guān)腦水腫的形成中起重要作用[8]。

MacLellan等[3]使用向基底節(jié)區(qū)注射自體全血的ICH大鼠模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在建模成功后1 h或4 h開(kāi)始BH處理，均能夠減輕腦水腫、血腦屏障功能紊亂及炎性細(xì)胞的滲透。本研究結(jié)果表明ICH后3～24 h內(nèi)開(kāi)始BH處理對(duì)ICH大鼠均有神經(jīng)保護(hù)作用，與NT組相比，大鼠ICH后腦水腫的形成明顯受到抑制，這提示延遲的亞低溫治療對(duì)ICH后腦水腫的形成仍是有效的；而且ICH后6 h進(jìn)行BH處理能夠減少病灶處DNA的氧化損傷，改善大鼠行為功能缺損。這些效應(yīng)并不是BH的生理學(xué)作用結(jié)果，因?yàn)樵谒写笫笪窗l(fā)生ICH的對(duì)側(cè)大腦半球中，未發(fā)現(xiàn)上述結(jié)果，這提示HT本質(zhì)上沒(méi)有影響正常腦組織中水含量及DNA的氧化損傷。本研究所使用的ICH動(dòng)物模型，早期有研究表明基底節(jié)區(qū)的腦水腫在ICH后24 h逐漸形成，大約4 d后才會(huì)逐漸消退[9]。ICH后24 h使用BH處理，能夠迅速減輕大鼠血腦屏障損傷[10]。所以在本研究中，將HT的處理時(shí)間選定為24 h，在早期腦水腫形成階段對(duì)其進(jìn)行干預(yù)。之前有研究指出在缺血及創(chuàng)傷性腦損傷中，BH的治療時(shí)間窗很窄[11-12]。但是，根據(jù)筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ICH后3～24 h使用BH處理，均能夠限制基底節(jié)區(qū)的血管源性水腫，這種效應(yīng)的作用機(jī)制可能是BH治療改善血腫周圍區(qū)域血腦屏障損傷，并減少了DAN氧化應(yīng)激損傷，從而改善了大鼠行為學(xué)功能缺損。

ICH及缺血的繼發(fā)性損傷有很多共同機(jī)制，包括炎癥、水腫及氧化應(yīng)激等，ICH后早期的BH治療能夠減輕ICH大鼠模型血腦屏障的通透性損傷、PMN白細(xì)胞積累及腦水腫[13-14]。但MacLellan等[3]指出，在膠原酶誘導(dǎo)的ICH模型中，建模成功后立即開(kāi)始BH處理，無(wú)法減輕腦組織損傷或行為學(xué)缺損。該結(jié)果可能與BH的不良反應(yīng)有關(guān)(如血壓升高及凝血功能紊亂等)，這些不良反應(yīng)能夠與BH對(duì)早期ICH的益處相抵消。隨后，他們提出在膠原酶誘導(dǎo)的ICH模型中，建模成功后12 h開(kāi)始BH處理，大鼠的行為學(xué)缺損有明顯改善，腦組織損傷也明顯減少，因?yàn)樵贗CH發(fā)病后短時(shí)間進(jìn)行BH內(nèi)容易加重出血[15]。

本研究存在一些不足之處：沒(méi)有判定延遲的BH對(duì)ICH大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用是否為長(zhǎng)期存在的；本研究并沒(méi)有明確精準(zhǔn)的BH治療ICH的時(shí)間窗。在設(shè)計(jì)本研究時(shí)，將最晚的時(shí)間設(shè)定為ICH后24 h，因?yàn)槿绻鸅H處理在晚于ICH后24 h開(kāi)始，將不能緩解 ICH早期腦損傷。有關(guān)延遲BH(ICH發(fā)生后2～3 d)是否能夠減輕自體血注射誘導(dǎo)的ICH大鼠模型的腦水腫還需要進(jìn)一步研究。

總的來(lái)說(shuō)，BH能夠顯著降低ICH后的腦水腫，即使在ICH后24 h才進(jìn)行BH治療。BH能夠減輕血腦屏障功能損害、炎性反應(yīng)、DNA的氧化應(yīng)激損傷。

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Delayed hypothermia on perihemorrhagic edema after intracerebral hemorrhage in rats

Zhao Juncang, Liu Xiaohong, Su Yuqing, Yang Huatang, Wang Xianming

(Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei, China)

Objective It is to evaluate the effect of delayed brain hypothermia (BH) (35℃) on brain edema formation 48 hours after intracerebral hemorrhage (ICH). Methods After the injection of 100μL of autologous blood into the basal ganglia to induce ICH in Sprague-Dawley rats, the rats were divided into two groups: hypothermia group (HT) and normal temperature group (NT). BH was started 3, 6, 12, and 24 hours after ICH in HT group which were divided into HT3, HT6, HT12 and HT24 group. Water content in cerebral tissue in every group in 48h after ICH was detected and compared, blood-brain barrier (BBB) permeability, and oxidative DNA damage in the lesion were compared between normothermic (NT) (37 ℃,n=7) and HT6 rats 48 hours after ICH. Finally, neurologic recovery was assessed using behavioral tests in NT and HT6 rats 48 hours after ICH. Results Brain water content in the ispilateral basal ganglia was significantly reduced in each HT subgroup compared with NT (P<0.01). The BBB disruption to Evans blue was significantly reduced with BH (HT6) compared with NT rats in the ipsilateral basal ganglia (P<0.05). HT treatment also significantly reduced oxidative DNA damage determined with 8-hydroxyl-2'-deoxyguanosine compared with NT treatment (P<0.05). Furthermore, HT6 treatment significantly improved neurologic recovery assessed with forelimb placing score compared with NT treatment (P<0.05). Conclusion Delayed BH can significantly reduce the brain edema formation after ICH, several neuroprotective mechanisms including reduced BBB disruption, inflammation and oxidative damage are suggested in this study.

brain edema; brain hypothermia; intracerebral hemorrhage; oxidative damage

趙軍蒼，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科臨床診治和研究工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.13.008

R-332

A

1008-8849(2014)13-1389-03

2013-11-04