益氣類中藥對(duì)博萊霉素所致肺纖維化大鼠血管新生機(jī)制的影響

張偉，鄭建，朱雪，王麗芹，楊景青，李瑩瑩，郭俊美

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014)

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是由各種原因引起的急慢性間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)的最終結(jié)局，以肺部炎癥導(dǎo)致肺泡持續(xù)性損傷及細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積為病理特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，以往對(duì)于肺泡炎性變化、肺泡上皮損傷和成纖維細(xì)胞的增殖研究較多，而對(duì)于肺血管在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的變化及VEGF在肺纖維化中的作用研究較少。國外多項(xiàng)研究證實(shí)，肺纖維化與肺血管生成之間有著密切的關(guān)系［1－2］。本研究通過觀察肺纖維化大鼠肺組織病理形態(tài)及VEGF的表達(dá)水平，探討益氣類中藥對(duì)肺纖維化大鼠的作用及其機(jī)制。

1 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)分析

1.1 數(shù)據(jù)收集

以“咳嗽，肺痿，肺痹，間質(zhì)性肺病，特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(特發(fā)性肺纖維化，特發(fā)性肺間質(zhì)性肺炎)，非特異性間質(zhì)性肺炎，塵肺，矽肺;中藥，方劑”等為主題詞，以知網(wǎng)、維普、萬方、Elsevier ScienceDirect數(shù)據(jù)庫為主要檢索目標(biāo)，檢索自有文獻(xiàn)記錄以來所有報(bào)道的臨床治療和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中用到的中藥單藥及復(fù)方，對(duì)其中符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)進(jìn)行篩選，按照“十一五規(guī)劃教材”中國中醫(yī)藥出版社出版的《中藥學(xué)》中的分類方法，將其歸類，建立數(shù)據(jù)表格。

1.2 數(shù)據(jù)分析方法

采用頻數(shù)分析方法，計(jì)算藥物的種類及每味藥的使用頻次。對(duì)使用頻次超過5次以上的藥物，按藥物的功效主治以分層聚類法進(jìn)行聚類分析，SPSS 17.0軟件完成。采用Apriori算法挖掘藥對(duì)配伍規(guī)律，設(shè)最小支持度2%，可信度100%。結(jié)果見圖1。

1.3 數(shù)據(jù)分析結(jié)果

通過以上分析方法顯示，文獻(xiàn)中治療肺纖維化最常用的有活血化瘀類中藥、化痰類中藥、益氣類中藥、補(bǔ)陰類中藥、清熱解毒類中藥等，該結(jié)果表明益氣類中藥在肺纖維化臨床治療中有著重要的作用，結(jié)果還顯示益氣類中藥中常用的配伍組合為黨參和黃芪，因此本研究選用黨參、黃芪作為益氣類中藥代表藥物。

圖1 數(shù)據(jù)分析結(jié)果

2 儀器與動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量(200±20)g(山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK(魯)20110003)。益氣類中藥(黨參、黃芪)、強(qiáng)的松(山東省中醫(yī)院);博萊霉素 (invitrogen公司，批號(hào)1134142);10%水合氯醛(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院);PCR(BIO －RAD，CFX96)。

3 方法

3.1 分組及造模 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、模型組、益氣組、潑尼松組，每組8只，模型組、益氣組、潑尼松組均采用博萊霉素(BLM)復(fù)制大鼠肺纖維化模型，氣管內(nèi)一次性按體質(zhì)量(5mg/Kg)注入博萊霉素溶液A5(5mg/ml)，空白組以同樣方法注入等體積生理鹽水。

3.2 給藥 造模后第2天起，益氣組每日以黨參(生藥量1.8g/Kg)、黃芪(生藥量 2.7g/Kg)水煎液灌胃，潑尼松組每日以潑尼松混懸液(3mg/Kg)灌胃，持續(xù)28天。

3.3 觀察指標(biāo)

3.3.1 病理學(xué)觀察 第28天，各組大鼠以10%水合氯醛(50mg/Kg)腹腔注射麻醉，取左肺下葉用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。病理切片行HE染色，采用Mikawa的［3］方法進(jìn)行大鼠肺組織病理評(píng)分。根據(jù)以下四項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行觀察:1)肺泡充血;2)出血;3)間隙或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤或聚集;4)肺泡間隔增厚或透明膜形成。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):極輕度損傷0分;輕度損傷1分;中度損傷2分;重度損傷3分;嚴(yán)重?fù)p傷4分，以上四項(xiàng)得分相加作為總分。

3.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)肺組織中 VEGF的表達(dá)

取右肺下葉組織，洗凈稱取質(zhì)量后，采用Trizol一步法提取肺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以cDNA為模板，在反應(yīng)體系中加入目的基因和內(nèi)參照基因的引物，設(shè)定參數(shù)，進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。目的基因序列:VEGF－F5’－CCTGGCTTTACTGCTGTACCT－3’，VEGF– R5’－GCTGGTAGACGTCCATGAACT－3’;內(nèi)參(GAPDH)－F5’－ACGATACGGCTTGGACTCTGA－3’，GAPDH －R5’－AGACTTGGTAAGTTCGCCTTCG－3’。反應(yīng)條件:95℃5min 進(jìn)入循環(huán)，95℃10s，72℃30s，40 個(gè)循環(huán)。

3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.01差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察

空白組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁無充血、水腫，肺泡腔無出血，未見纖維化組織;模型組大鼠肺組織正常肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔融合、閉陷、消失，大量炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)毛細(xì)血管密集，纖維組織增生明顯;益氣組大鼠肺組織正常肺泡結(jié)構(gòu)輕微破壞，肺泡間隔輕度增厚，少量炎性細(xì)胞浸潤和纖維組織增生，間質(zhì)毛細(xì)血管明顯少于模型組;潑尼松組大鼠肺組織正常肺泡結(jié)構(gòu)輕－中度破壞，肺泡間隔略增厚，少量炎性細(xì)胞浸潤，可見纖維組織增生，間質(zhì)毛細(xì)血管明顯少于模型組。結(jié)果見圖2和表1。

表1 各組大鼠肺組織病理評(píng)分(s)

表1 各組大鼠肺組織病理評(píng)分(s)

注:與空白組比較，△P ＜0.01;與模型組比較，▲P ＜0.01;與益氣組比較，☆P ＜0.05。

組別 n 病理評(píng)分空白組0.00 ±0.00模型組 8 6.00 ±1.20△益氣組 8 3.00 ±0.76△▲潑尼松組 8 4.38 ±1.60 8△▲☆

圖2 各組大鼠組織病理學(xué)結(jié)果

模型組纖維化程度最重，與其他組相比較有顯著性差異(P＜0.01);益氣組、潑尼松組纖維化程度較模型組明顯減輕(P＜0.01)，益氣組較潑尼松組療效更好，二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

4.2 各組大鼠肺組織中VEGF－mRNA表達(dá)水平

與空白組比較，模型組VEGF－mRNA的表達(dá)水平明顯增高，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，益氣組VEGF－mRNA的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，潑尼松組較模型組VEGF－mRNA表達(dá)水平無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠肺組織中VEGF－mRNA的表達(dá)水平(s)

表2 各組大鼠肺組織中VEGF－mRNA的表達(dá)水平(s)

注:與空白組比較，△P ＜0.01;與模型組比較，▲P ＜0.01;與益氣組比較，☆P ＜0.05。

VEGF－mRNA空白組組別n 30.20 ±20.26模型組 8 115.88 ±17.58△益氣組 8 62.76 ±18.23△▲潑尼松組 8 94.58 ±31.11 8△☆

5 討論

肺纖維化是一種以彌漫性肺泡炎、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、肺間質(zhì)纖維增生為特征的肺部疾病，預(yù)后較差，目前尚缺乏有效的治療措施，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。近年來許多研究表明，肺纖維化與肺血管生成之間有密切關(guān)系，調(diào)節(jié)過度血管生成可能會(huì)延緩肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

VEGF是一種特異的作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞因子，在肺內(nèi)可由上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，也可由肺間質(zhì)細(xì)胞分泌。VEGF具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、促進(jìn)血管形成，并增加血管通透性和維持血管正常狀態(tài)和完整性的作用［4］。在肺纖維化形成過程中，VEGF在肺組織中的高表達(dá)，可誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖，且VEGF作用于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，能增加毛細(xì)血管的通透性，使血漿、炎細(xì)胞外滲，從而造成肺間質(zhì)水腫及肺間質(zhì)內(nèi)大量的炎細(xì)胞浸潤。而大量纖維蛋白原的外滲，形成了細(xì)胞外基質(zhì)，為內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞遷移，新生毛細(xì)血管網(wǎng)的建立提供了必要的基質(zhì)，從而使成纖維細(xì)胞的聚集增加，膠原纖維合成和分泌增加并沉積在肺間質(zhì)內(nèi)，促進(jìn)了肺纖維化的形成［5］。VEGF的表達(dá)水平能夠反映血管新生的程度。

本研究結(jié)果顯示，模型組VEGF－mRNA表達(dá)水平較空白組明顯增高，表明VEGF在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，與文獻(xiàn)一致;益氣組和潑尼松組較模型組VEGF－mRNA表達(dá)水平明顯降低，表明益氣類中藥和潑尼松對(duì)肺纖維化均有明顯的治療作用，而益氣類中藥在此機(jī)制上的調(diào)節(jié)效果優(yōu)于潑尼松;病理形態(tài)學(xué)觀察也同樣證實(shí)了這個(gè)結(jié)論，益氣組和潑尼松組大鼠的肺纖維化程度較模型組均明顯減輕，間質(zhì)毛細(xì)血管也較模型組明顯減少。筆者推測(cè)這可能與益氣類中藥和潑尼松能夠抑制VEGF－mRNA的表達(dá)有關(guān)，它們可能是通過抑制VEGF－mRNA的表達(dá)而改善肺纖維化大鼠毛細(xì)血管的通透性，減少炎性細(xì)胞及纖維蛋白原的滲出，從而起到抗炎和減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積的作用;還能抑制肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的過分增殖，維持血管正常狀態(tài)，延緩肺纖維化大鼠肺毛細(xì)血管新生，防止肺動(dòng)脈高壓的行成，從而延緩肺纖維化進(jìn)展。此外，中醫(yī)認(rèn)為肺纖維化屬“肺痿”范疇，氣虛血瘀貫穿疾病始終，益氣類中藥既可補(bǔ)氣，改善氣虛，又能補(bǔ)氣［6］以行血，延緩血瘀的行成，從而達(dá)到治療疾病的目的。

綜上所述，益氣類中藥對(duì)肺纖維化大鼠有明顯的治療作用，其機(jī)制可能與降低VEGF的表達(dá)水平有關(guān)，本研究的這一發(fā)現(xiàn)為探索肺纖維化的發(fā)病機(jī)制和中醫(yī)藥防治肺纖維化的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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