冷凍胚胎解凍后質(zhì)量對臨床妊娠結(jié)局的影響

趙杰，陳秀娟，劉芳，梁琳，梁磊，王薩仁，侯石磊

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，呼和浩特 010050）

凍融胚胎移植（FET）已成為輔助生殖技術(shù)（ART）中最重要的衍生技術(shù)之一，它不僅能夠合理限制新鮮周期移植胚胎數(shù)、降低多胎率、提高單次取卵周期累計(jì)妊娠率，而且還可避免由于多次超促排卵給患者帶來的醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)和治療費(fèi)用。影響FET臨床妊娠結(jié)局的因素較多，而胚胎復(fù)蘇后情況及胚胎的發(fā)育潛能是影響因素之一。本研究回顧分析了我中心冷凍胚胎融解后存活情況及過夜培養(yǎng)后發(fā)育情況對臨床妊娠結(jié)局的影響。

材料與方法

一、研究對象

選擇2012年5月至2013年10月在本中心因新鮮周期未移植及新鮮周期移植妊娠失敗行FET的患者，共303 例，349個周期，女性患者平均年齡（32.7±4.9）歲、范圍23～42歲，不育年限（5.15±4.08）年、范圍1～16年。各組年齡、獲卵數(shù)比較無顯著性差異，不育原因?yàn)榕蕉嗄衣殉簿C合征、輸卵管阻塞、男方無精子或少精子癥、行夫精人工授精3周期失敗及不明原因不育等，排除子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥等有明確影響子宮內(nèi)膜環(huán)境的患者。內(nèi)膜準(zhǔn)備方案為自然周期183 個，人工替代周期166個。

二、方法

1.控制性超促排卵：新鮮取卵周期的控制性促排卵方案按照我中心常規(guī)方案［1］進(jìn)行，根據(jù)患者情況，選擇超長方案、長方案、短方案、拮抗劑方案進(jìn)行促排卵，在超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵手術(shù)，取卵后常規(guī)行體外受精（IVF）、卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）及胚胎培養(yǎng)。

2.冷凍胚胎選擇：胚胎質(zhì)量評分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)文獻(xiàn)［2］進(jìn)行評級：選擇Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級胚胎，且第2日細(xì)胞數(shù)≥2，第3日細(xì)胞數(shù)≥4；碎片≤50% 的胚胎用于冷凍。

3.胚胎冷凍及解凍：采用玻璃化冷凍試劑套裝（Vitrolife，瑞典）進(jìn)行冷凍，用冷凍環(huán)（Hampton Research，美國）作為載體。冷凍過程：所用試劑均要求在37℃下平衡30 min，將胚胎放入含有10mg／ml人血清白蛋白（HSA）的磷酸緩沖液（PBS）中平衡5min；移入含10mg／ml HSA、7.5%乙二醇（EG）及7.5% 二甲基亞砜（DMSO）的PBS（冷凍液1）中2 min；將胚胎移入含10 mg／ml HSA、15%EG 及15%DMSO 的PBS（冷凍液2）中，反復(fù)吹吸，將冷凍環(huán)在冷凍液2中蘸一下，形成液體膜，用吸管將胚胎放入冷凍環(huán)液體膜上，置入液氮中，將冷凍環(huán)旋到冷凍管上（胚胎在冷凍液2中的時(shí)間為20～30s）。解凍過程：于移植前一天下午解凍，解凍前將解凍試劑（Vitrolife，瑞典）平衡至37℃，將含胚胎的冷凍環(huán)小心旋下冷凍管，從液氮取出，空氣中2s，置入復(fù)蘇液Ⅰ（含1.0mol／L 蔗糖及10mg／ml HSA 的PBS）中，停留30s，轉(zhuǎn)移到復(fù)蘇液Ⅱ（含0.5 mol／L 蔗 糖 及10 mg／ml HSA 的PBS）中停留1min，再移到復(fù)蘇液Ⅲ（含0.25mol／L蔗糖及10mg／ml HSA 的PBS）中停留2min，最后在平 衡 液（含10 mg／ml HSA 的PBS）中 平 衡5min，移至已平衡的含5mg／ml HSA 的囊胚培養(yǎng)液（Vitrolife，瑞典）中。

4.胚胎培養(yǎng)及觀察：解凍后的胚胎放到平衡好的囊胚培養(yǎng)液中，檢查透明帶的完整性、卵漿的透亮程度，如有50% 以上卵裂球受損，則視為死亡。在6%CO2、5%O2、89%氮?dú)馀囵B(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。移植日觀察復(fù)蘇后胚胎情況，觀察胚胎是否生長，將胚胎情況進(jìn)行記錄。

5.分組：（1）根據(jù)所移植胚胎卵裂球的損傷程度，分為3 組：移植的胚胎均無損傷的為完整組（A1，n＝193），全部移植的胚胎均有卵裂球損傷的為損傷組（A2，n＝30），移植既有無卵裂球損傷的胚胎又有卵裂球損傷的胚胎為損傷混合組（A3，n＝126）。（2）解凍后胚胎經(jīng)過夜培養(yǎng)，根據(jù)其生長情況分為3組：所移植胚胎均有不同程度生長的胚胎為生長組（B1，n＝187），所移植胚胎均未見生長的胚胎為未生長組（B2，n＝46），所移植胚胎既有生長的胚胎又有未生長胚胎即為生長混合組（B3，n＝116）。（3）在生長組及生長混合組中，根據(jù)胚胎是否發(fā)育為桑葚胚情況，分為2組：有胚胎達(dá)到桑葚胚狀態(tài)的為桑葚胚組（C1，n＝86），無胚胎達(dá)到桑葚胚狀態(tài)的為無桑葚胚組（C2，n＝217）。

6.內(nèi)膜及黃體準(zhǔn)備：內(nèi)膜準(zhǔn)備方案：自然周期：月經(jīng)第10 天起B(yǎng) 超監(jiān)測，主導(dǎo)卵泡平均直徑達(dá)14mm時(shí)，開始檢測血清中黃體生成素（LH）值，出現(xiàn)峰值后第4 天行FET；如主導(dǎo)卵泡發(fā)育到16～20mm時(shí)，未測出LH 峰，則肌注人絨毛膜促性腺激素（HCG，麗珠醫(yī)藥）5 000 ～10 000U，第4天后行FET。激素替代周期：月經(jīng)第2 天起予口服補(bǔ)佳樂（BAYER，法國），行陰道B 超監(jiān)測，子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm 時(shí)，肌注黃體酮（P，浙江仙琚制藥）40 ～60mg／d，于肌注P的第5天行FET。

7.確定妊娠及隨訪：移植后14 d 行血清β-HCG 檢測，提示未妊娠即停用P，若血清β-HCG檢測提示妊娠，則繼續(xù)黃體支持。移植后24d超聲檢查見孕囊、胚芽，移植后35d超聲檢查心管搏動者確定為臨床妊娠，繼續(xù)黃體支持至妊娠10～12周。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

釆用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基本情況

共解凍303例患者的349個周期，無取消周期；解凍胚胎834 個，存活789 個，存活率94.60%；移植胚胎789 個，種植170 個，種植率21.55%；妊娠144個周期，平均妊娠率41.26%；活產(chǎn)96個周期，活產(chǎn)率66.67%；流產(chǎn)（包括早、中、晚期）44個周期，流產(chǎn)率30.56%；異位妊娠6個周期，占4.17%。

二、胚胎損傷情況對妊娠結(jié)局的影響

解凍后移植胚胎完整組（A1）共193個周期，妊娠率45.08%，種植率24.25%，活產(chǎn)率70.11%，流產(chǎn)率27.59%；損傷組（A2）共30 個周期，妊娠率20%，種植率11.11%，活產(chǎn)率50%，流產(chǎn)率50%；損傷混合組（A3）126個周期，妊娠率40.48%；種植率19.72%，活產(chǎn)率62.75%，流產(chǎn)率33.33%（表1）。完整組（A1）在妊娠率、種植率上顯著高于損傷組（A2）（P＝0.01、P＝0.002），損傷混合組（A3）在妊娠率上顯著高于損傷組（A2）（P＝0.036），活產(chǎn)率及流產(chǎn)率比較，組間無顯著性差異（P＞0.05）。

三、胚胎生長情況對妊娠結(jié)局的影響

過夜培養(yǎng)后，生長組（B1）187 個周期，妊娠率47.06%，種植率26.34%，活產(chǎn)率69.32%，流產(chǎn)率27.27%；未 生 長 組（B2）46 個 周 期，妊 娠 率34.78%；種植率為17%，活產(chǎn)率68.75%，流產(chǎn)率31.25%；生 長 混 合 組（B3）116 個 周 期，妊 娠 率34.48%，種植率為16.13%，活產(chǎn)率55.0%，流產(chǎn)率37.5%。生長組（B1）妊娠率顯著高于生長混合組（B3）（P＝0.031），而種植率顯著高于未生長組（B2）及生長混合組（B3）（P＝0.049、0.002）；活產(chǎn)率及流產(chǎn)率無顯著性差異（表1）。

四、過夜培養(yǎng)后有無桑葚胚對妊娠結(jié)局的影響

過夜培養(yǎng)后，生長組、生長混合組共計(jì)303個周期，桑葚胚組（C1）86個周期，妊娠47個周期，妊娠率為54.65%，種植率為28.28%；無桑葚胚組（C2）共217個周期，妊娠81個周期，妊娠率為37.33%，種植率為19.76%（表1）。兩組妊娠率、種植率比較均有顯著差異（P＝0.006、0.015）；兩組活產(chǎn)率及流產(chǎn)率無顯著性差異（表1）。

討 論

ART 臨床應(yīng)用中，現(xiàn)多在D3卵裂期胚胎進(jìn)行移植，胚胎冷凍也多在此階段進(jìn)行［3］。冷凍胚胎解凍后卵裂球的存活程度反映了胚胎的內(nèi)在質(zhì)量，能更好地承受冷凍過程的胚胎有著更好的發(fā)育潛能［4］，冷凍和解凍過程中，一些胚胎的卵裂球細(xì)胞可能會損傷，這些損傷細(xì)胞可影響其他細(xì)胞生存及胚胎的進(jìn)一步發(fā)育。雖有報(bào)道，細(xì)胞部分壞死的冷凍胚胎與細(xì)胞完整冷凍胚胎相比有相同的發(fā)育潛力，但冷凍過程本身可引起重要的細(xì)胞內(nèi)改變［5］，冷凍胚胎的壞死細(xì)胞可能對存活細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，減少胚胎發(fā)育潛能等［6］。

表1 解凍后胚胎損傷情況及胚胎生長情況與臨床結(jié)局［（±s），n（%）］

表1 解凍后胚胎損傷情況及胚胎生長情況與臨床結(jié)局［（±s），n（%）］

注：與損傷組（A2）比較，△P＜0.05；與生長組（B1）比較，＊P＜0.05；與無桑葚胚組（C2）比較，＃P＜0.05

組 別 周期數(shù) 年齡（歲） 獲卵數(shù)（個） 移植數(shù)（個） 妊娠率 種植率 活產(chǎn)率 流產(chǎn)率 異位妊娠率完整組（A1） 193 32.74±5.16 11.15±7.48 2.26±0.58 87／193（45.08）△106／437（24.25）△61／87（70.11）24／87（27.59）2／87（2.29）損傷組（A2） 30 32.92±5.72 12.33±7.16 2.1±0.66 6／30（20.00）7／63（11.11） （3／6） （3／6） 0損傷混合組（A3） 126 32.49±4.60 10.43±7.15 2.29±0.54 51／126（40.48）△4／51（7.84）組 別 周期數(shù) 年齡（歲） 獲卵數(shù)（個） 移植數(shù)（個） 妊娠率 種植率 活產(chǎn)率 流產(chǎn)率 異位妊娠率57／289（19.72）32／51（62.75）17／51（33.33）生長組（B1） 187 32.05±5.34 11.21±7.52 2.19±0.55 88／187（47.06）108／410（26.34）61／88（69.32）24／88（27.27）3／88（3.41）未生長組（B2） 46 32.07±5.22 11.89±6.8 2.17±0.57 16／46（34.78）17／100（17.00）＊11／16（68.75）5／16（31.25） 0生長混合組（B3） 116 32.76±4.70 10.35±7.27 2.41±0.57＊ 40／116（34.48）＊45／279（16.13）＊22／40（55.00）15／40（37.50）3／40（7.50）組 別 周期數(shù) 年齡（歲） 卵數(shù)（個） 移植數(shù)（個） 妊娠率 種植率 活產(chǎn)率 流產(chǎn)率 異位妊娠率有桑葚胚（C1） 86 32.03±4.90 12.06±7.44 2.30±0.58 47／86（54.65）＃無桑葚胚（C2） 217 33.17±5.45 10.96±7.40 2.26±0.57 81／217（37.33）56／198（28.28）＃97／491（19.76）30／47（63.83）53／81（65.43）15／47（31.91）24／81（29.63）2／47（4.26）4／81（4.94）

本研究中，損傷組妊娠率顯著低于完整組及損傷混合組，種植率顯著低于完整組，提示胚胎的損傷程度是影響妊娠結(jié)局的因素。在活產(chǎn)率上損傷組（50.0%）及損傷混合組（62.75%）均低于完整組（70.11%），而 流 產(chǎn) 率 卻 高 于 完 整 組（分 別 為50.0%、33.33%、27.59%），但無顯著性差異，可以認(rèn)為胚胎的損傷也是活產(chǎn)率降低及流產(chǎn)率升高的因素之一。然而，可能由于本研究數(shù)據(jù)量較少而未顯現(xiàn)出有顯著性差異，故有待進(jìn)一步觀察。

在對完整組、損傷組、損傷混合組過夜培養(yǎng)后觀察胚胎生長情況，發(fā)現(xiàn)完整組、混合組及損傷組胚胎的生 長 率 逐 漸 降 低（分 別 為78.03%、62.63%、49.21%），且三組比較差異均有顯著性，所以胚胎卵裂球損傷情況是影響胚胎生長的因素之一。

提前解凍胚胎，過夜培養(yǎng)后觀察復(fù)蘇后胚胎是否繼續(xù)生長，對于評價(jià)胚胎種植潛能具有很大的意義［7］。Van der Elst等［8］認(rèn)為，復(fù)蘇后卵裂球繼續(xù)發(fā)育可能對于著床時(shí)胚胎與子宮內(nèi)膜的同步性更有利。此外，Laverge等［9］對復(fù)蘇后無生長的胚胎進(jìn)行熒光原位雜交，發(fā)現(xiàn)這類胚胎往往表現(xiàn)染色體異常，包括單倍體、三倍體、四倍體甚至六倍體和嵌合體的發(fā)生，僅有20% 左右的胚胎表現(xiàn)為正常的二倍體，因此提出建議不要移植這類復(fù)蘇后無進(jìn)一步生長的胚胎。本研究顯示，胚胎解凍后過夜培養(yǎng)，所移植胚胎均有生長的生長組在妊娠率、種植率上高于無生長組及生長混合組，可見胚胎經(jīng)過夜培養(yǎng)后有卵裂球細(xì)胞生長能夠顯著提高種植率及妊娠率，生長混合組及未生長組在妊娠率、種植率上水平相當(dāng)，對于這一類患者來說，只要胚胎有未生長的，則預(yù)示此周期中所移植的胚胎發(fā)育潛能均不是很好，對妊娠及種植不利。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在未生長組、生長混合組、生長組中的胚胎有損傷的病例占的比例分別是75%、53%及38%。由此可見，解凍后，細(xì)胞部分壞死的胚胎與細(xì)胞完整胚胎相比，其發(fā)育潛能較差，從而影響到妊娠率及種植率，并最終影響到活產(chǎn)率及流產(chǎn)率。

桑葚胚是有發(fā)育潛能的早卵裂期胚胎發(fā)育而來，本研究顯示，復(fù)蘇D3 卵裂期胚胎經(jīng)過夜培養(yǎng)后，在生長組及混合生長組周期中，有發(fā)育到桑葚胚周期的妊娠率及種植率上均顯著性高于未見到桑葚胚的周期，可見在第4天發(fā)育到桑葚胚的胚胎，其發(fā)育潛能較在第4天未見到桑葚胚的要高，這種胚胎往往預(yù)示著在第5天就能夠發(fā)育為囊胚，從而是能夠獲得較高的妊娠率，與陳雅等［10］的報(bào)道相符合。

綜上所述，復(fù)蘇D3卵裂期胚胎，卵裂球細(xì)胞的壞死情況影響妊娠結(jié)局，經(jīng)過夜培養(yǎng)，有卵裂球細(xì)胞生長的胚胎能夠獲得較高的種植率及妊娠率，且生長為桑葚胚的病例妊娠率及種植率均高于未獲得桑葚胚的病例?？梢娺x擇質(zhì)量較好的胚胎進(jìn)行冷凍，可使胚胎冷凍、解凍技術(shù)而對胚胎損傷的減少，亦是提高凍融胚胎妊娠結(jié)局的關(guān)鍵。

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