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    PFT-α對腦缺血后神經(jīng)干細胞移植中PUMA的 調控研究

    2014-08-10 12:28:32劉洋雷旭輝殷實蔣傳路
    疑難病雜志 2014年11期
    關鍵詞:氧糖存活腦缺血

    劉洋,雷旭輝,殷實,蔣傳路

    論著·基礎

    PFT-α對腦缺血后神經(jīng)干細胞移植中PUMA的 調控研究

    劉洋,雷旭輝,殷實,蔣傳路

    目的探索p53抑制劑(PFT-α)對腦缺血后神經(jīng)干細胞(NSCs)中p53下游促凋亡基因(PUMA)的表達影響。方法利用SD仔鼠分離 NSCs,原代及傳代培養(yǎng),經(jīng)氧糖剝奪(OGD)處理6 h后分為OGD+二甲基亞砜(DMSO)組和OGD+ PFT-α組,采用免疫印跡技術比較2組p53蛋白及PUMA的表達變化。體內實驗中采用Longa法建立經(jīng)CT證實的大腦中動脈栓塞模型大鼠48只,隨機分為PFT-α+NSCs移植組(n=24)和DMSO+NSCs 移植組(n=24);采用免疫熒光技術檢測不同移植組中PUMA的表達。結果(1)體外實驗中氧糖剝奪6 h后OGD+PFT-α組中p53蛋白入核水平下調,胞漿內表達上調,而OGD+DMSO組主要表達位于胞核;PUMA的表達水平明顯低于OGD+DMSO組(P<0.05);(2)體內實驗中,與DMSO+NSCs組相比,PFT-α+NSCs移植組中PUMA表達陽性的細胞明顯減少 [(38.9±4.3)% vs. (29.4±5.6)%,P<0.01]。結論PFT-α與神經(jīng)干細胞聯(lián)合應用后,可明顯抑制PUMA的表達,這可能是PFT-α促進移植后神經(jīng)干細胞在腦缺血區(qū)存活的重要機制。

    PFT-α;p53下游促凋亡基因;神經(jīng)干細胞;腦缺血;凋亡

    干細胞移植治療缺血性腦卒中是近年來研究的熱點之一,具有廣闊的應用前景。然而,干細胞移植后存活率較低成為限制其臨床應用的主要障礙。Bliss等[1]研究證實p53基因在神經(jīng)干細胞 (neural stem cells,NSCs) 中高表達,缺血性腦損傷可激活p53基因,進而發(fā)揮其促凋亡作用誘導細胞凋亡[2]。此外,在小鼠腦缺血模型中,應用p53的抑制劑能顯著增加室管膜下層神經(jīng)前體細胞的存活,增殖并抑制p53依賴的促凋亡基因表達[3]。有研究顯示[4],NSCs聯(lián)合p53抑制劑(PFT-α)移植可顯著提高移植后NSCs的存活,但機制尚不明確。p53上調凋亡調控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis,PUMA)是 Yu 等[5]在2001年最早發(fā)現(xiàn)于結腸癌細胞中的一種促凋亡基因,因其可以被p53快速誘導并具有強大促凋亡作用而得名。近年來,PUMA已成為研究的熱點之一,作為p53下游靶基因之一,PUMA 在p53依賴和非依賴的凋亡過程中均發(fā)揮了重要作用。然而,抑制p53表達后提高NSCs的存活是否與PUMA的表達有關罕有報道。本文旨在研究體內外條件下,應用PFT-α聯(lián)合NSCs移植促進移植后的NSCs存活過程中PUMA表達水平的變化,為增加干細胞移植后的效果提供新的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物: 選取體質量240~270 g的雄性SD大鼠48只,均由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心(動物合格證號:SCXK[黑]2013-001)提供。

    1.1.2 主要試劑和儀器設備: CFMDA (Invitrogen 公司),PFT-α (>98%,上海碧云天),小鼠抗大鼠p53單克隆抗體(美國Abcam),兔抗大鼠PUMA單克隆抗體(美國Abcam)。鼠腦立體定向儀 (上海Alcbio),倒置相差顯微鏡 (日本,OLYMPUS IX-70),激光共聚焦顯微鏡 (日本Fluoview 1000; Olympus)。

    1.2 方法

    1.2.1 NSCs的分離及鑒定: 參照Rietze等[6]和Chojnacki等[7]的方法,取新生24 h內的SD仔鼠,處死,將包含皮質及室管膜下區(qū)的腦組織移入離心管,反復吹打成單細胞懸液。尼龍網(wǎng)過濾,離心后向細胞沉淀內加入DMEM/F12神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)液,吹散后按 2×106/cm2密度接種于6 cm培養(yǎng)皿,后置于37℃,5% CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng)。每3~4天半量換液,每7~9天傳代,細胞傳至第3代后進行相關實驗。

    1.2.2 NSCs的氧糖剝奪處理: 取培養(yǎng)至第3代的神經(jīng)球,以膠原酶(0.5 mg/ml)消化5~10 min后,制成單細胞懸液,按200 μl培養(yǎng)液含2×104/孔的細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板。實驗分組:(1)氧糖剝奪(OGD)+二甲基亞砜(DMSO)組:細胞應用OGD培養(yǎng)液替換正常培養(yǎng)液接種后,在37℃,5% CO2,1% O2,94%的N2條件下培養(yǎng)6 h。(2)OGD+ PFT-α組: 細胞在上述氧糖剝奪的條件下培養(yǎng),并加入0~160 μmol/L濃度梯度的PFT-α。

    1.2.3 大鼠大腦中動脈栓塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)建立及分組: 選取體質量240~270 g的雄性SD大鼠,參照Longa等[8]提出的線栓法建立大鼠可逆性大腦中動脈閉塞 (tMCAO)。頭部CT證實模型建立均成功,隨機分為:(1) PFT-α + NSCs移植組 (n=24):大鼠移植的神經(jīng)干細胞在移植前經(jīng)PFT-α (10 μmol/L)預處理30 min,細胞移植后經(jīng)腹腔途徑給大鼠注射1次劑量的PFT-α (2 mg/kg)。(2) DMSO + NSCs 移植組 (n=24):大鼠移植的神經(jīng)干細胞在移植前經(jīng)DMSO (10μmol/L)預處理30 min,細胞移植后經(jīng)腹腔途徑給大鼠注射1次劑量的DMSO (20 μl溶于1 ml 生理鹽水)。

    1.2.4 神經(jīng)干細胞移植: 大鼠以10%水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔麻醉后,固定于立體定向儀上。以冠狀點為中心以下列標識AP=1.0 mm, ML=+3.0 mm, DV=5.0 mm定位腦內移植位點。切開頭皮,顱骨鉆孔。微量注射器腦內注入2 μl含有3×106的神經(jīng)干細胞,注射速度每分鐘0.5 μl;注射后留針5 min拔針;拔針速度為每分鐘<1 mm;大鼠接受細胞移植后嚴密觀察3~6 h。

    1.2.5 觀測指標與方法:

    1.2.5.1 免疫印跡技術 體外實驗中,分離培養(yǎng)后的NSCs在氧糖剝奪條件下處理6 h后,收取蛋白樣本,參照文獻[9]轉膜完畢后,放入5%的脫脂牛奶中封閉1 h,加入適當濃度的以3%BSA稀釋的一抗兔抗大鼠PUMA單克隆抗體(1∶1 000),4℃過夜孵育,TBS/T液洗膜6次,5 min/次;加入相應種屬的二抗溶于5%的脫脂牛奶中(一般比例為1∶5 000),室溫孵育1 h,洗膜,應用ECL顯影,在暗室曝光成像;應用Smart View凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值。

    1.2.5.2 免疫熒光染色 體內實驗中,不同組實驗動物在給予相應治療后12 h,處死取腦,凍存切片備用。參照文獻[10]將冰凍切片置入4%的多聚甲醛染色缸中固定30 min,PBS/T(0.1% Tween)漂洗和0.2%的Triton X-100(溶于PBS)穿透20 min,用PBS洗滌3次,用含1%BSA(10%山羊血清)的PBS封閉60 min。用含1%BSA的PBS稀釋的小鼠抗大鼠p53單克隆抗體(1∶50),山羊抗大鼠PUMA 單克隆抗體37℃培養(yǎng)箱內作用60 min,4℃孵育過夜。去除一抗,用PBS洗滌去除洗滌液,加入1%BSA稀釋好的熒光二抗(1∶200)室溫孵育60 min。PBS/T洗滌及染核后在熒光顯微鏡下觀察。

    1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示,組間比較采用t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結 果

    2.1 PFT-α在體外對NSCs中PUMA表達的影響 體外條件下在氧糖剝奪處理6 h后,OGD+ PFT-α組限制了p53蛋白向細胞核內移位,P53主要位于細胞漿部分,使p53蛋白不能作為轉錄因子啟動其依賴的促凋亡機制,而OGD+DMSO組p53主要位于細胞核部分(圖1);與OGD+DMSO組比較,OGD+PFT-α組神經(jīng)干細胞中PUMA表達明顯降低(P<0.05)(圖2),說明PFT-α在體外條件下作用神經(jīng)干細胞后能夠抑制PUMA蛋白的表達。

    圖1 免疫印跡法檢測氧糖剝奪處理對神經(jīng)干細胞中p53表達的影響

    圖2 免疫印跡法檢測氧糖剝奪處理對神經(jīng)干細胞PUMA表達的影響

    2.2 PFT-α對NSCs移植后PUMA表達的影響 移植后12 h,神經(jīng)干細胞中PUMA陽性細胞較常見(圖3、4,見封3),PUMA陽性細胞占移植神經(jīng)干細胞的比率,PFT-α+ NSCs移植組為(29.4±5.6)%;DMSO+NSCs移植組為(38.9± 4.3)%,2組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);而在神經(jīng)干細胞移植后24 h,很少有PUMA的表達。說明PFT-α與神經(jīng)干細胞聯(lián)合應用后早期,可明顯抑制p53下游的促凋亡基因PUMA的表達,這可能是其促進神經(jīng)干細胞移植后在腦缺血區(qū)存活的重要機制。

    3 討 論

    近年的研究表明,在腦缺血損傷早期,p53會作為一個轉錄因子被激活,啟動其下游的促凋亡基因如:p21、WAF、 Peg3/Pw1、Bax、 Noxa、PUMA等的轉錄表達,誘導神經(jīng)細胞凋亡[11,12]。PUMA是2001年發(fā)現(xiàn)的p53靶基因,可以被p53快速誘導并具有強大促凋亡作用。近些年來研究表明不同臟器在缺血再灌注后,通過p53的激活,誘導PUMA的表達上調,誘導細胞經(jīng)線粒體途徑的凋亡。通過基因敲除技術去除PUMA基因后,DNA損傷誘導的p53依賴的凋亡顯著減少[13]。PUMA基因敲除后的神經(jīng)元,能夠明顯減少p53依賴的凋亡[14]。在實驗性大鼠腦缺血模型實驗中發(fā)現(xiàn),在腦缺血發(fā)生4 h后,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的PUMA表達明顯增多,在應用了p53抑制劑后,可明顯減少這種PUMA的上調,減少神經(jīng)細胞凋亡的產(chǎn)生[15,16]。這些研究說明,p53/PUMA通路在缺血再灌注損傷中的重要作用,可能成為缺血再灌注損傷防治的一個靶點。在本實驗中,我們將神經(jīng)干細胞移植于腦缺血區(qū)同時給予p53抑制劑,觀察對移植于腦缺血區(qū)后神經(jīng)干細胞中PUMA的影響,結果表明,在體外實驗中,氧糖剝奪處理6 h后的神經(jīng)干細胞在應用 p53抑制劑后,PUMA表達明顯降低;體內實驗中,PFT-α與神經(jīng)干細胞移植聯(lián)合應用明顯抑制p53下游基因PUMA的表達,結果證實了p53抑制劑PFT-α對神經(jīng)干細胞移植治療腦缺血過程中p53誘導PUMA蛋白表達的抑制作用,從而抑制了移植于腦缺血區(qū)的神經(jīng)干細胞凋亡,提高神經(jīng)干細胞的存活,改善了干細胞移植效率,起到較好的治療效果。由此可見PUMA在p53抑制劑促進神經(jīng)干細胞存活過程中的關鍵作用。當然,其他的機制或是其他的促凋亡通路也可能參與到移植后神經(jīng)干細胞凋亡過程中。在今后的研究中,多種抗凋亡方法的聯(lián)合應用,可能是提高移植后干細胞存活的重要手段。

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    StudyonregulatingofPFT-αtothePUMAinneuralstemcellstransplantationaftercerebralischemia

    LIUYang,LEIXuhui,YINShi,JIANGChuanlu.

    DepartmentofNeurosurgery,SecondAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,HeilongjiangProvince,Harbin150001,China

    JIANGChuanlu,E-mail:jcl6688@163.com

    ObjectiveTo explore the effect of p53 inhibitor (PFT-α) on neural stem cells after cerebral ischemia in p53 downstream apoptotic gene (PUMA) expression.MethodsUsing SD rat to isolate NSCs, through the primary and passage culture, by oxygen glucose deprivation (OGD) treatment for 6 h, they were divided into OGD+ dimethyl sulfoxide (DMSO) group and OGD+ PFT-α group, changes of expression of the p53 protein and PUMA by immunoblotting technique were compared between the 2 groups. In vivo tests using Longa method to establish the CT confirmed the brain artery embolism model in 48 rats, they were randomly divided into PFT-α+NSCs transplantation group (n=24) and DMSO+NSCs transplantation group (n=24) ; using immunofluorescence to detect the PUMA expression in the different groups of transplantation.Results(1) In vitro oxygen glucose deprivation after 6 h, OGD+PFT-α group’s p53 protein into the nucleus level decreased, expression is up-regulated in the cytoplasm, while OGD+DMSO group was mainly expressed in the cell nucleus; the expression level of PUMA was significantly lower than that in OGD+DMSO group (P<0.05); (2)In vivo experiment, compared with the DMSO + NSCs group, PFT-α+NSCs PUMA transplantation group’s positive expression cells was significantly reduced [(38.9±4.3)% vs. (29.4±5.6)%,P<0.01].ConclusionThe PFT-α combined with neural stem cells can inhibit the expression of PUMA, which may be an important mechanism of PFT-α to promote cell survival in the cerebral ischemic area after the transplantation of neural stem.

    PFT-alpha; PUMA; Neural stem cells; Cerebral ischemia; Apoptosis

    黑龍江省科學基金資助項目 (No.ZJY0604-02)

    150001 哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科

    蔣傳路,E-mail:jcl6688@163.com

    10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.11.017

    2014-07-05)

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