云南燈盞花根腐病的2種新病原鑒定及防治藥劑的室內篩選

賴寶春，胡先奇，羅文富

(1.福建省漳州市農業(yè)科學研究所，漳州 363005； 2.云南農業(yè)大學，云南省植物病理重點實驗室， 昆明 650201)

云南燈盞花根腐病的2種新病原鑒定及防治藥劑的室內篩選

賴寶春1，胡先奇2，羅文富2

(1.福建省漳州市農業(yè)科學研究所，漳州 363005； 2.云南農業(yè)大學，云南省植物病理重點實驗室， 昆明 650201)

引起云南省燈盞花根腐病的病原為茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)和半裸鐮刀菌(F.semitectum)3種真菌，茄病鐮刀菌和尖孢鐮刀菌為燈盞花根腐病的2種新病原，其中茄病鐮刀菌為主要致病菌，其分離率為42.86%，茄病鐮刀菌有傷接種發(fā)病率為70%，無傷接種發(fā)病率為56.7%。采用室內生長速率法測定了50%多菌靈可濕性粉劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、64%惡霜·錳鋅可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、10億活芽胞/g 枯草芽胞桿菌·熒光假單胞桿菌可濕性粉劑5種供試殺菌劑對燈盞花根腐病主要病原茄病鐮刀菌的毒力。結果表明：5種供試藥劑對茄病鐮刀菌都有抑制作用。對茄病鐮刀菌的有效中濃度(EC50)分別為0.0004、0.0507、0.0535、0.0813和8.624 0mg/mL，其中50%多菌靈可濕性粉劑有效中濃度最低，相對抑制效果最好。5種藥劑的毒力相關系數均在0.89以上，表明藥劑質量濃度與抑制作用呈較高相關性。

燈盞花； 根腐??； 病原鑒定； 毒力測定； 致病性

燈盞花[Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand.-Mazz.]又名短葶飛蓬、燈盞細辛，屬菊科飛蓬屬植物，以全草或根入藥，為多年生草本。我國主要分布于西部及西南部高山和亞高山開闊山坡草地和林緣地區(qū)[1]。近年來，由于大面積的人工栽培，燈盞花根腐病的危害逐年加重，已成為限制燈盞花大面積種植的主要因素之一。目前有關燈盞花根腐病的病原已有報道[2-3]，由于采集地點不同及分離接種部位的差異，結果各不一樣，且該病害的藥劑防治也未見報道。筆者于2003-2006年對云南省燈盞花種植區(qū)進行了系統(tǒng)調查，對引起燈盞花根腐病的病原進行了鑒定，并選用5種殺菌劑對該病害進行了室內毒力測定，為生產上防治該病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌分離鑒定材料

通過對云南省燈盞花種植區(qū)個舊、彌勒、玉溪、瀘西等地進行系統(tǒng)調查，觀察燈盞花根腐病的田間癥狀特點，采集田間典型的發(fā)病標樣，當天用塑料袋密封并帶回實驗室及時分離。

1.1.2 供試藥劑

共5種殺菌劑：50%多菌靈可濕性粉劑(江蘇省新沂農藥有限公司)、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(日本曹達株式會社制造)、64%惡霜·錳鋅可濕性粉劑(先正達(蘇州)作物保護有限公司)、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑(先正達(中國)投資有限公司)、10億活芽胞/g 枯草芽胞桿菌·熒光假單胞桿菌可濕性粉劑(昆明沃霖生物工程有限公司，云南農業(yè)大學植物病理重點實驗室監(jiān)制)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離和培養(yǎng)

選取初期發(fā)病的典型病株，在病健交界處用小剪刀將發(fā)病材料(根、莖基部)剪成4 mm×4 mm的小塊，用70%乙醇和0.1%的升汞表面消毒，再經無菌水漂洗3～4次，移入PSA平面培養(yǎng)基，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。待長出菌落邊緣挑取菌絲純化培養(yǎng)，再做單孢分離，并初步鑒定分離物，純化后轉管保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測定

從云南師范大學購買組培苗，待組培苗長到2～3片真葉時，移栽到裝有滅菌土的花盆中(d=20cm)，保濕管理，待植株長到5片葉子以上，即可進行接種試驗。用無菌水配制成2×106個/mL的孢子懸浮液備用。分別采用刺傷接菌和無傷接菌2種方法進行，用滅過菌的注射器針尖將燈盞花根、莖基部刺傷，造成一定的傷口，將已經準備好的孢子懸浮液噴灑在有傷口和無傷口的部位，對照用滅菌水。5種分離物刺傷接種和無傷接種10個處理，滅菌水刺傷接種和無傷接種2個處理，共12個處理，每處理接種30株，接種后的燈盞花移到大棚，24 h保濕，觀察并記錄發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌鑒定

將經致病性測定后重新獲得的分離物分別置于PSA培養(yǎng)基上，25 ℃下培養(yǎng)，不能產生大孢子的可以在綜合培養(yǎng)基和VBC培養(yǎng)基[4]上再培養(yǎng)。4 d后測量菌落生長速率，觀察培養(yǎng)性狀，15 d后觀察形態(tài)特征，并進行顯微觀測和照相記錄，20d后觀察厚垣孢子形態(tài)及色素的顏色。根據文獻[4-7]進行鑒定。

1.2.4 殺菌劑室內毒力篩選

采用生長速率法[8]測定藥劑的抑菌作用。在無菌條件下，將供試的5種藥劑用滅菌水分別配成5個所需體積質量濃度，分別取200μL的藥劑溶液加入10mL PDA培養(yǎng)基中攤平。將擴大培養(yǎng)8 d的病原菌打成直徑為0.4 cm的菌餅，將菌餅移入帶毒培養(yǎng)基中培養(yǎng)。設加滅菌水的PDA培養(yǎng)基為空白對照。5種藥劑和空白對照共31個處理，每個處理設3次重復。置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，4 d后觀察抑菌情況。用十字交叉法測量菌落直徑，計算生長抑制率。

生長抑制率(%)=[(對照菌落直徑—處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100；

將抑制生長百分率換算成幾率值，濃度換算成濃度對數。以濃度對數為自變量x,以幾率值為變量y，建立毒力回歸方程y=a+bx,毒力回歸方程能有效地反映該藥劑濃度與抑菌效果的關系，從毒力回歸方程求出每個藥劑的抑制中濃度EC50。

2 結果與分析

2.1 癥狀描述

燈盞花根腐病在整個生育期均會發(fā)病，密植、氮肥施用過多、高濕的田塊發(fā)病嚴重，病菌沿行傳播蔓延，田間發(fā)病率一般為10%～15%，嚴重的超過30%。受病原菌危害的燈盞花地上部與健康植株相比較為矮小，長勢弱，中下部葉片黃化，萎蔫，花少，莖基部變黑腐爛，發(fā)病初期先由須根、支根變褐腐爛，最后全根腐爛，地上部自莖尖向下枯萎至全株枯死(圖1)。

2.2 分離物的分離頻率

在PSA培養(yǎng)基上分離純化得到5種真菌，它們分別為茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、半裸鐮刀菌、鏈格孢、厚孢輪枝菌。其中茄病鐮刀菌和鏈格孢分離頻率較高，分別為42.86%和28.57%，其次是尖孢鐮刀菌，分離頻率為17.86%，半裸鐮刀菌和厚孢輪枝菌分離頻率為7.10%和3.57%。

2.3 致病性測定結果

結果表明，除了茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)孢鐮刀菌(F.oxysporum)和半裸鐮刀菌(F.semitectum)具有致病性外,其他真菌分離物均不能引起燈盞花發(fā)病。各菌株侵染致病的潛伏期較短，接種8 d后開始顯癥，15 d后達到發(fā)病的高峰期。三種鐮刀菌中茄病鐮刀菌致病性最強，刺傷接種發(fā)病率為70.0%，無傷接種發(fā)病率為56.7%；尖孢鐮刀菌刺傷接種發(fā)病率為30.0%，無傷接種發(fā)病率為16.7%；半裸鐮刀菌刺傷接種發(fā)病率最低為20.0%，無傷接種發(fā)病率為10.0%。癥狀表現和田間發(fā)病植株相一致，對照不發(fā)病。從接種發(fā)病的組織中重新分離的病原菌，與接種的病原菌完全一致。

圖1 燈盞花根腐病田間癥狀Fig.1 Symptoms of Erigeron breviscapus root rot in field

表1 5種病原菌對燈盞花根部的致病性測定Table 1 Pathogenicity test of five pathogens causing the root rot of Erigeron breviscapus

2.4 致病菌的培養(yǎng)性狀及孢子形態(tài)特征

茄病鐮刀菌：在PSA培養(yǎng)基上，25 ℃條件下4 d后菌落直徑為4.4 cm，氣生菌絲棉絮狀，呈蒼白色至淺灰色，間有土黃色的分生孢子座，基物表層肉色，培養(yǎng)基不變色。顯微鏡下觀察，小型分生孢子數量多，卵形、腎形，假頭狀著生，大小為(10～21.5)μm×(3.0～4.5)μm。大型分生孢子生于氣生菌絲、分生孢子梗座和黏孢團中，橢圓形彎曲，頂端細胞短、圓鈍，有時喙狀，基端細胞圓鈍，大小為(25.0～39.5)μm×(3.9～6.5)μm。厚垣孢子多，卵形，在菌絲或孢子頂端或中間單生、間生，直徑(6.2～9.8)μm。產孢細胞單瓶梗，在氣生菌絲上為長筒形，在分生孢子座上成簇產生，多分枝，長短不一，大小為(31.2～101.4)μm×(2.6～3.4)μm(圖2 a，b)。

尖孢鐮刀菌：PSA培養(yǎng)基上25 ℃下培養(yǎng)4 d后菌落直徑為5.5 cm，氣生菌絲羊毛狀，白至粉白色，基物本身無色。小型分生孢子數量多，腎形，假頭狀著生在產孢細胞上，大小為(6.0～12.5)μm×(2.5～3.2)μm。大型分生孢子鐮刀狀，稍彎，多數3個隔，大小為(15.0～32.6)μm×(3.5～4.0)μm。容易產生厚垣孢子，球形，單生、對生或串生，直徑為(6.5～8.0)μm。產孢細胞單瓶梗，較短(圖2 c，d)。

半裸鐮刀菌：PSA培養(yǎng)基上25 ℃下培養(yǎng)4 d后菌落直徑為5.8 cm，氣生菌絲棉絮狀，白至淺駝色，基物不變色。大型分生孢子生于氣生菌絲中，多數3～5個隔，分生孢子披針形、紡錘形至鐮形，具楔形腳孢及彎曲的頂端細胞，大?。?11.0～40.2)μm×(2.6～4.5)μm。厚垣孢子球形，直徑(5.5～10.0)μm。產孢細胞為多芽生(圖2 e，f)。

2.5 防治藥劑的篩選

用生長速率法測定結果(表2)表明，50%多菌靈可濕性粉劑對菌絲生長抑制效果最好，在藥劑質量濃度為0.002 5～0.01mg/mL多菌靈的PDA培養(yǎng)基上接種4 d后，菌絲生長的平均抑制率均為85%以上。70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對菌絲生長抑制效果較好，在藥劑質量濃度為0.3～0.7 mg/mL甲基硫菌靈的PDA培養(yǎng)基上接種4 d后，菌絲生長的平均抑制率均為74.93%～80.0%。在藥劑質量濃度為0.15～0.6mg/mL苯醚甲環(huán)唑的PDA培養(yǎng)基上接種4 d后，菌絲生長的平均抑制率均為56.72%～81.79%。64%惡霜靈錳鋅可濕性粉劑抑菌效果次之，10億活芽孢/g 枯草芽孢桿菌·熒光假單胞桿菌可濕性粉劑抑菌效果最差，在藥劑質量濃度為2～4 mg/mL，平均抑制率為30.75%～40.90%。

圖2 燈盞花根腐病病原菌的微觀形態(tài)特征Fig.2 Microscopic morphological characters of the pathogens from root rot of Erigeron breviscapus

表2 五種藥劑不同濃度對燈盞花根腐病菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effects on five fungicides at different concentrations on root rot of Erigeron breviscapus

2.6 五種藥劑的毒力及EC50

室內毒力測定結果(表3)表明：10億活芽胞/g 枯草芽胞桿菌·熒光假單胞桿菌可濕性粉劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、50%多菌靈可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、64%惡霜·錳鋅可濕性粉劑的有效中濃度(EC50)分別為8.624 0、0.0507、0.0004、0.0813mg/mL和0.0535 mg/mL，其中50%多菌靈可濕性粉劑有效中濃度最低，相對抑制效果最好；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、64%惡霜·錳鋅可濕性粉劑次之；10億活芽胞/g 枯草芽胞桿菌·熒光假單胞桿菌可濕性粉劑最差。5種藥劑的相關系數均在0.89以上，表明藥劑濃度與抑制作用呈現較高的相關性。

表3五種藥劑對燈盞花根腐病菌的毒力回歸方程與EC50

Table3ThetoxicityequationandEC50ofthefivefungicidesagainstthepathogenofrootrotofErigeronbreviscapus

藥劑Fungicide毒力回歸方程(y=)ToxicityregressionequationEC50/mg·mL-1R10億活芽胞/g枯草芽胞桿菌·熒光假單胞桿菌WP1billionlivespore/gBacillussubtilisandPseudomonasfluorescensWP4．2403+0．8119x8．62400．981470%甲基硫菌靈WP70%Thiophanate?methylWP6．0427+0．8052x0．05070．965550%多菌靈WP50%CarbendazimWP13．7110+2．5719x0．00040．890710%苯醚甲環(huán)唑WG10%DifenoconazoleWG5．9772+0．8968x0．08130．983264%惡霜·錳鋅WP64%Oxadixyl·mancozebWP6．6183+1．2728x0．05350．9868

3 討論與結論

3.1 病原菌的分離和鑒定

目前為止，有關引起云南省燈盞花根腐病的病原菌說法各不一樣，杜賓等[2]報道，引起云南省昆明市燈盞花根腐病的病原菌為擬枝孢鐮刀菌(F.sporotrichioides)，分離部位為根部，分離物經單孢分離后，接種方式為刺傷根部灌根接種；林麗飛等[3]報道云南省栽培區(qū)燈盞花根腐病的病原菌為半裸鐮孢(F.semitectum)和膠孢鐮孢(F.subglutinans)，分離部位為根部，分離物沒有經過單孢分離，純化后以刺傷根部接種。不同地區(qū)燈盞花根腐病病原菌不同的原因，一是采樣調查的地域及環(huán)境條件不同，引起燈盞花發(fā)生根腐病的病原菌可能存在差異；二是分離部位不同，病原菌主要侵染燈盞花的根部和莖基部。筆者采樣調查的地市與林麗飛相同，但采集基地不同；本試驗從燈盞花的根部和莖基部進行分離，分離物經過單孢分離，以有傷接種和無傷接種2種方式于燈盞花根部和莖基部進行接種；本試驗通過對云南省燈盞花主栽培區(qū)燈盞花根腐病的田間調查、采樣、分離、鑒定、致病性測定及再分離的結果表明，茄病鐮刀菌(F.solani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)和半裸鐮刀菌(F.semitectum)為引起燈盞花根腐病的病原菌，其中茄病鐮刀菌和尖孢鐮刀菌是引起燈盞花根部病害的2種新病原。

鐮刀菌可引起多種藥用植物的根腐病，很多文獻報道由尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌、半裸鐮刀菌引起藥用植物巴戟天、三七、竹節(jié)人參、高山紅景天、麻黃、黃芪、白術等的根腐病已成為藥用植物生產的主要障礙[9-11]。有研究表明藥用植物的根腐病與地下線蟲、根螨的危害有關，在土壤黏重，田間積水過多時發(fā)病嚴重[12]。本課題組調查的多種寄生線蟲[13-15]引起的燈盞花線蟲病，筆者認為這些寄生線蟲的危害造成傷口可能為根腐病菌的侵入創(chuàng)造了有利的條件。張紹升[16]認為寄生線蟲與病原微生物的共同侵染導致植物病害所造成的損失遠遠大于兩種病原物單獨危害的結果。因此，燈盞花寄生線蟲與根腐病菌的復合侵染接種有待進一步深入研究。

3.2 藥劑防治研究

在燈盞花根腐病的藥劑防治方面，目前國內還沒有關于藥劑對燈盞花根腐病菌毒力測定的相關報道。本試驗根據藥劑的特性及燈盞花不同生育期、不同季節(jié)篩選了5種對燈盞花根腐病菌有一定抑制效果的殺菌劑并對其室內抑菌毒力進行了測定。選用的5種殺菌劑均為廣譜、高效、低毒的藥劑，其中10億活芽胞/g 枯草芽胞桿菌·熒光假單胞桿菌可濕性粉劑為生物殺菌劑，說明書上介紹該藥劑對鐮刀菌引起的植物根腐病有顯著的防治效果。室內對燈盞花根腐病菌分生孢子萌發(fā)抑制率為99.32%，但對菌絲的抑制效果較差，可作為燈盞花苗期或發(fā)病前期的預防使用。50%多菌靈可濕性粉劑和10%苯醚甲環(huán)唑可濕性粉劑對由半知菌引起的植物病害有較好的防效；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑和64%惡霜·錳鋅可濕性粉劑能有效防治植物多種病害，4種化學殺菌劑均有較強的內吸傳導性，在多雨的季節(jié)也可使用，對燈盞花根腐病菌菌絲均有較好的抑制效果，可在燈盞花根腐病發(fā)病初期或中期使用。

殺菌劑的室內毒力測定只是為燈盞花根腐病的田間防治提供參考，需要進一步的溫室盆栽測定及田間藥效測定確定其田間防效。中藥材是人們用來防病、治病、保健的特殊商品。在燈盞花根腐病的防治上提倡使用生物農藥進行預防和防治，發(fā)病較重的情況下可選用安全、低毒、高效的化學農藥，應減少化學農藥的使用次數和用量。

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IdentificationofthetwonewpathogensofrootrotdiseaseonErigeronbreviscapusandscreeningoffungicides

Lai Baochun1，Hu Xianqi2，Luo Wenfu2

(1.ZhangzhouInstituteofAgriculturalSciencesofFujianProvince,Zhangzhou363005,China； 2.KeyLaboratoryforPlantPathologyofYunnanProvince,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China)

The three pathogens causing root rot ofErigeronbreviscapusin Yunnan Province were identified asFusariumsolani,F.oxysporumandF.semitectum,among whichF.solaniandF.oxysporumwere two new pathogens; the main pathogen wasF.solani,and the isolation frequency was 42.86%.After artificial inoculation with or without wounds,the incidence of roots infected byF.solaniwas 70% and 56.7%,respectively.With mycelium growth rate test method,five fungicides toF.solanihad inhibition effects,indicating that the EC50values of 50% carbendazim WP,70% thiophanate-methyl WP,64% oxadixyl·mancozeb WP,10% difenoconazole WG,and 1billion live spores ofBacillussubtilisandPseudomonasfluorescensWP were 0.0004 mg/mL,0.0507 mg/mL,0.0535 mg/mL,0.0813mg/mL and 8.624 0mg/mL,respectively,suggesting that 50% carbendazim WP was the best.The correlation coefficients for the five fungicides were all above 0.89,indicating that mass concentration had high correlation with inhibition.

Erigeronbreviscapus； root rot disease； identification of pathogen； toxicity test； pathogenicity

2013-04-22

：2013-07-08

云南省教育廳科研基金(0111343)；福建省重點引智項目(SZ2011037)

S 435.67

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.028

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