葡萄霜霉病菌PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

秦文韜，黃曉慶，孔繁芳，王忠躍，張 昊

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

葡萄霜霉病菌PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

秦文韜，黃曉慶，孔繁芳，王忠躍*，張 昊*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

通過(guò)對(duì)已測(cè)序和已報(bào)道的葡萄霜霉病菌[Plasmoparaviticola(BerketCurtis) Ber.etde Toni]細(xì)胞色素c氧化酶亞型2(cytochrome c oxidase Ⅱ，cox2)的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)用于P.viticola的檢測(cè)引物F-Pv/R-Pv。利用該引物對(duì)包括P.viticola在內(nèi)的30種常見植物病原真菌(包括15種Plasmopara屬真菌、8種葡萄常見致病菌)的基因組DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證引物F-Pv/R-Pv的特異性，結(jié)果表明：該引物特異性強(qiáng)，僅P.viticola基因組DNA作為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)一條600bp左右的特異性條帶，其他參照菌株及陰性對(duì)照均無(wú)任何條帶；靈敏度驗(yàn)證結(jié)果表明，該檢測(cè)法可以檢測(cè)出3.3pg/μL 水平的P.viticola基因組DNA；應(yīng)用該方法對(duì)來(lái)自全國(guó)不同葡萄產(chǎn)區(qū)的不同品種的78份葡萄霜霉病菌進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，該檢測(cè)法適用范圍廣，且檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)100%。

葡萄霜霉病菌；cox2； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 檢測(cè)

葡萄霜霉病是世界和我國(guó)葡萄的第一大病害，發(fā)生面積逐年擴(kuò)大，成為優(yōu)質(zhì)葡萄生產(chǎn)的重要限制因素，一般年份可減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重的可達(dá)70%～80%，并嚴(yán)重影響第二年產(chǎn)量，是現(xiàn)階段制約世界和我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)的一大瓶頸[1]。葡萄霜霉病菌屬鞭毛菌亞門，卵菌綱，霜霉目、霜霉科、單軸霉屬的一種專性寄生真菌，該病菌主要侵染植株的幼嫩器官，如嫩葉、嫩梢和幼果。如果防治不及時(shí)，霜霉病會(huì)導(dǎo)致葡萄植株葉片脫落，枝梢扭曲，對(duì)葡萄樹勢(shì)、產(chǎn)量和品質(zhì)都有很大的影響。該病在春夏季多雨潮濕的地區(qū)，如歐洲、日本、新西蘭、南非、阿根廷、澳大利亞?wèn)|部以及我國(guó)的大部分地區(qū)均有發(fā)生[2]。

真菌的某些基因序列，如ITS序列，β-tublin(TUB) 基因，cox2基因等，在種內(nèi)不同菌株間具有高度的保守性，又在屬間和屬內(nèi)不同種間存在著豐富的多態(tài)性，利用這一特性對(duì)該基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析后再設(shè)計(jì)特異性引物來(lái)進(jìn)行植物病原真菌的分子檢測(cè)是目前被廣泛接受的一種技術(shù)，PCR技術(shù)憑借其快速、準(zhǔn)確、重演性好的優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)成為植物病原檢測(cè)的核心技術(shù)，得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[3-5]。

本研究旨在建立葡萄霜霉病菌PCR檢測(cè)技術(shù)，以期為葡萄霜霉病的綜合防控提供新的思路，推動(dòng)葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用的葡萄霜霉病菌B1～B6待檢的78份葡萄霜霉病樣品(表1)分別采自全國(guó)不同葡萄種植區(qū)(全國(guó)15個(gè)省，2個(gè)直轄市，3個(gè)自治區(qū))和不同葡萄品種，引物特異性驗(yàn)證試驗(yàn)中供試的24種參照菌株來(lái)源見表2。

表1田間樣品的來(lái)源

Table1Sourcesofthesamplesinthefield

菌株編號(hào)Strainnumber菌株來(lái)源Source葡萄品種Variety菌株編號(hào)Strainnumber菌株來(lái)源Source葡萄品種Variety菌株編號(hào)Strainnumber菌株來(lái)源Source葡萄品種Variety菌株編號(hào)Strainnumber菌株來(lái)源Source葡萄品種Variety1河北石家莊巨峰21甘肅蘭州紅地球41北京通州黃意大利61黑龍江哈爾濱京秀2廣西南寧巨峰22河南鄭州紅地球42北京通州紅寶石無(wú)核62河北石家莊藤稔3山西太谷巨峰23河北保定紅地球43北京通州巨玫瑰63河北秦皇島赤霞珠4河北秦皇島巨峰24寧夏銀川紅地球44北京通州香妃64河北張家口西拉5湖南洪江巨峰25江蘇南京紅地球45北京通州無(wú)核白雞心65河北廊坊秋黑6湖北武漢巨峰26安徽合肥紅地球46北京通州甲斐乙女66河北廊坊黃意大利7四川成都彭鎮(zhèn)巨峰27天津武清紅地球47北京通州奧迪亞67河北廊坊莫麗莎8河北保定巨峰28山西太谷紅地球48北京通州維多利亞68河北廊坊夏黑9甘肅蘭州巨峰29四川成都彭鎮(zhèn)紅地球49北京通州京早晶69山東濟(jì)南貴妃玫瑰10河南鄭州巨峰30河北廊坊紅地球50北京通州魏可70山東青島紫脆無(wú)核11四川成都永安鎮(zhèn)巨峰31河北保定紅地球51北京通州無(wú)核早紅71北京大興玫瑰香12北京通州巨峰32四川成都永安鎮(zhèn)紅地球52湖南岳陽(yáng)寶石72天津武清維多利亞13安徽合肥巨峰33北京大興紅地球53湖南岳陽(yáng)紅寶石73廣西羅城毛葡萄14福建福州巨峰34遼寧大連紅地球54湖南岳陽(yáng)夏黑74廣西金州毛葡萄15河北廊坊巨峰35新疆石河子紅地球55湖南懷化刺葡萄75寧夏銀川霞多麗16云南大理紅地球36北京通州紅地球56湖南洪江夏黑76浙江磬安藤稔17河北石家莊紅地球37北京通州美人指57湖北武漢夏黑77浙江余姚藤稔18河北秦皇島紅地球38北京通州貴妃玫瑰58黑龍江哈爾濱紅香水78福建福州京亞19遼寧熊岳紅地球39北京通州奧古斯特59黑龍江哈爾濱無(wú)核白雞心20湖北武漢紅地球40北京通州里扎馬特60黑龍江哈爾濱山葡萄

表2引物F-Pv/R-Pv特異性驗(yàn)證所用菌株及其PCR檢測(cè)結(jié)果

Table2StrainsusedforspecificityvalidationofF-Pv/R-PvandtheirresultsofPCRamplification

菌株編號(hào)Number拉丁學(xué)名Latinname寄主(品種)Host(Variety)菌株來(lái)源SourcePCR結(jié)果PCRresult菌株編號(hào)Number拉丁學(xué)名Latinname寄主(品種)Host(Variety)菌株來(lái)源SourcePCR結(jié)果PCRresultB1Plasmoparaviticola葡萄(巨峰)中國(guó)吉林+B4P．viticola葡萄(魏可)中國(guó)遼寧+B2P．viticola葡萄(藤稔)中國(guó)山東+B5P．viticola葡萄(秋黑)中國(guó)湖北+B3P．viticola葡萄(京亞)中國(guó)河北+B6P．viticola葡萄(夏黑)中國(guó)廣西+1Plasmoparasp．地錦(未知)德國(guó)法蘭克福-13Phytophthorainfestans馬鈴薯本實(shí)驗(yàn)室保存-2Plasmoparasp．地錦(未知)德國(guó)法蘭克福-14Ph．boehmeriae棉花本實(shí)驗(yàn)室保存-3P．halstedii向日葵法國(guó)馬澤維爾-15Pythiumsp．蘆筍本實(shí)驗(yàn)室保存-4Plasmoparasp．向日葵(703)德國(guó)法蘭克福-16Peronosporafarinosa未知本實(shí)驗(yàn)室保存-5P．halstedii向日葵(701)法國(guó)馬澤維爾-17Guignardiabidwellii葡萄本實(shí)驗(yàn)室保存-6P．halstedii向日葵(未知)法國(guó)馬澤維爾-18Conielladiplodiella葡萄本實(shí)驗(yàn)室保存-7P．obducen鳳仙花南斯拉夫-19Botryotiniafuckeliana葡萄本實(shí)驗(yàn)室保存-8P．muraris地錦德國(guó)法蘭克福-20Botryosphaeriarhodina葡萄本實(shí)驗(yàn)室保存-9P．a(chǎn)ngustiterminalis蒼耳本實(shí)驗(yàn)室保存-21B．dothidea葡萄本實(shí)驗(yàn)室保存-10Albugoportulacae莧菜本實(shí)驗(yàn)室保存-22Uncinulanecator葡萄本實(shí)驗(yàn)室保存-11Phytophthoraparasitica煙草本實(shí)驗(yàn)室保存-23Colletotrichumgloeosporioides葡萄本實(shí)驗(yàn)室保存-12Ph．capsici辣椒本實(shí)驗(yàn)室保存-24Pestalotiamangiferae葡萄本實(shí)驗(yàn)室保存-

1.2 葡萄霜霉病菌基因組DNA的提取及cox2基因擴(kuò)增、測(cè)序

參考Xin等[6]報(bào)道的植物組織基因組DNA快速提取方法，略有改動(dòng)。具體步驟如下：用已滅菌的牙簽或槍頭刮取少量霉層置于0.5 mL PCR管中，加入50μL Buffer A溶液(100mmol/L NaOH，2%Tween?20，Buffer A用10mol/L NaOH和20%Tween?20現(xiàn)配現(xiàn)用)，95 ℃溫育10min；然后加入50μL Buffer B溶液(100mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA)，振蕩混勻，12 000r/min離心15 s，得到含有葡萄霜霉病菌基因組DNA溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系(20μL)：DNA模板1μL，10μmol/L的引物各1μL，20%PVP(W/V) 1μL，2% BSA(W/V) 1μL，2×PCR Mix 10μL，無(wú)菌水5 μL。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30s，50℃退火30s，72 ℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，產(chǎn)物用AxyPrep PCR清潔試劑盒純化，經(jīng)pGM-T載體連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性菌落，最后將篩選到的含有正確插入片段的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.3 特異性引物的設(shè)計(jì)

本研究根據(jù)已測(cè)序的結(jié)果、GenBank中已報(bào)道的葡萄霜霉病菌的cox2基因序列(DQ365760.1、EF426553.1、HM628744.1、HM628749.1等)，同時(shí)與已報(bào)道的Plasmoparaangustiterminalis(EU743812.1)、P.halstedii(EU743813)、P.penniseti(EF426475)、Peronosporaaparines(DQ365717)、Phytophthoracapsici(GU221961.1)、Pythiumadhaerens(HQ680578.1)等多種霜霉目真菌、常見的葡萄致病菌的cox2基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性的PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 引物特異性驗(yàn)證

分別以6種靶標(biāo)菌株DNA和24種參照菌株DNA為模板，用特異性引物F-Pv/R-Pv進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及程序同1.2，設(shè)置水為模板的陰性對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察結(jié)果。

1.5 引物靈敏度驗(yàn)證

用核酸濃度測(cè)定儀(Gene公司，NanoVue Plus)測(cè)定所提取的P.viticola基因組DNA濃度，并采用濃度梯度稀釋法將其稀釋到1～10-6ng/μL，然后利用特異性引物F-Pv/R-Pv，按1.2的反應(yīng)體系和程序分別對(duì)梯度稀釋的P.viticola基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察結(jié)果。

1.6 田間葡萄葉片組織中霜霉菌的檢測(cè)

按1.2所述的方法分別提取待檢樣品的DNA，并分別以所提取的待檢樣品的DNA、健康葡萄葉片DNA、水為模板，用特異性引物F-Pv/R-Pv進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系及程序同1.2，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性引物設(shè)計(jì)

將測(cè)序獲得的P.viticola菌株cox2基因序列與GenBank中其他菌株的cox2基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，根據(jù)序列之間的同源性和差異性，設(shè)計(jì)了P.viticola的特異性引物F-Pv/R-Pv(表3)，目的片段大小約為600bp。

表3葡萄霜霉病菌cox2基因PCR擴(kuò)增引物序列
Table3Primersequencesofcox2gene

引物名稱Primer引物序列Sequence(5′?3′)F?PvCAAGATCCAGCAACTCCAGTTATGGAR?PvACATTGTCCATAAAAAACACCTTGT

2.2 引物特異性驗(yàn)證

以所提取的30種菌株DNA為模板(表1)，用所設(shè)計(jì)的特異性引物F-Pv/R-Pv進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示：僅模板為P.viticola基因組DNA時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)出一條600bp左右的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，而對(duì)其他24種參照菌株和陰性對(duì)照均為陰性，無(wú)任何條帶，其中有16種為霜霉目真菌(包括9種Plasmopara屬真菌)，另外8種為其他目的常見葡萄致病菌(圖1)。特異性檢測(cè)結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的引物具有種間的相對(duì)特異性，能夠區(qū)別P.viticola與其他Plasmopara屬的病原真菌，同時(shí)，具有屬間相對(duì)特異性，能夠區(qū)別其與霜霉目的其他部分真菌及其他葡萄上常見的病原菌。

圖1 引物F-Pv/ R-Pv特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 Specificity validation of F-Pv/ R-Pv

2.3 引物靈敏度驗(yàn)證

用特異性引物F-Pv/R-Pv分別對(duì)不同濃度梯度的P.viticola基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)置無(wú)菌水為模板的陰性對(duì)照，結(jié)果顯示：隨著模板濃度的降低，瓊脂糖凝膠電泳條帶亮度逐漸變暗，模板濃度為3.3pg/μL的葡萄霜霉病菌基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物還能分辨出一條約600bp的特異性條帶(圖2)，而模板濃度小于3.3pg/μL以及無(wú)菌水對(duì)照均無(wú)明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明PCR法的靈敏度為3.3pg/μL。

2.4 發(fā)病葉片組織中葡萄霜霉病菌的檢測(cè)

用特異性引物F-Pv/R-Pv對(duì)來(lái)自于全國(guó)不同葡萄生態(tài)區(qū)域的78份葡萄霜霉病樣品DNA、健康葡萄葉片DNA、水分別進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，各地區(qū)的78份樣品均呈陽(yáng)性，均出現(xiàn)了預(yù)期的目標(biāo)條帶，條帶的亮度因模板濃度的不同有所差異，而健康葡萄葉片DNA和水作模板的陰性對(duì)照未出現(xiàn)目標(biāo)條帶(圖3)，檢測(cè)準(zhǔn)確率為100%，說(shuō)明引物F-Pv/R-Pv能特異性地檢測(cè)到發(fā)病葉片組織中的P.viticola基因組DNA的存在。

圖2 引物F-Pv/ R-Pv靈敏度驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 Sensitivity validation of F-Pv/ R-Pv

圖3 田間霜霉菌cox2基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR products of cox2 of Plasmopara viticola collected from fields

3 討論

葡萄霜霉病菌屬于專性寄生菌，很難進(jìn)行常規(guī)的分離培養(yǎng)，關(guān)于P.viticolaPCR檢測(cè)方面的相關(guān)報(bào)道較少，然而，PCR檢測(cè)技術(shù)在霜霉目真菌中的應(yīng)用已很廣泛，如Ioos等[7]建立的P.halstediiPCR檢測(cè)體系，能特異性地檢測(cè)出P.halstedii，靈敏度為3pg；Tooley等[8]建立的PhytophthoraPCR檢測(cè)體系，三種大小不同的PCR產(chǎn)物可以用于檢測(cè)馬鈴薯葉片和塊莖內(nèi)三種不同的致病菌，檢測(cè)靈敏度為1～10pg，為種薯和貯藏馬鈴薯內(nèi)P.infestans的檢測(cè)提供了有力工具；劉春來(lái)等[9]建立的大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)PCR檢測(cè)方法可以檢測(cè)出接種于土壤中的0.3個(gè)大豆疫霉菌游動(dòng)孢子和0.06個(gè)卵孢子，對(duì)染病組織的檢測(cè)也表現(xiàn)出了較高的靈敏度，這都為本研究葡萄霜霉病菌PCR檢測(cè)法的建立提供了借鑒。

本研究通過(guò)對(duì)已測(cè)序和已報(bào)道的葡萄霜霉病菌的cox2基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)用于P.viticola檢測(cè)的引物F-Pv/R-Pv。利用該引物對(duì)包括P.viticola在內(nèi)的30種常見植物病原真菌(包括15種Plasmopara屬真菌、8種葡萄常見致病菌)的基因組DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證引物F-Pv/R-Pv的特異性，結(jié)果表明：該引物特異性強(qiáng)，僅P.viticola基因組DNA作為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)一條600bp左右的特異性條帶，其他參照菌株及陰性對(duì)照均無(wú)任何條帶；靈敏度驗(yàn)證結(jié)果表明，該檢測(cè)法可以檢測(cè)出3.3pg/μL 水平的P.viticola基因組DNA；應(yīng)用該方法對(duì)來(lái)自全國(guó)不同葡萄產(chǎn)區(qū)不同品種的78份葡萄霜霉病菌進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，該檢測(cè)法適用范圍廣，且檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)100%。

[1] 王忠躍.中國(guó)葡萄病蟲害與綜合防控技術(shù)[M].北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2009.

[2] 李海強(qiáng).石河子地區(qū)葡萄霜霉病的發(fā)生規(guī)律及防治研究[D].新疆: 石河子大學(xué),2009.

[3] 王娜,馬雅軍,王喆之,等.PCR相關(guān)技術(shù)方法在植物病害檢測(cè)中的應(yīng)用[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2004,20(4): 112-115.

[4] 趙杰.序列分析及其在植物真菌病害分子檢測(cè)中的應(yīng)用[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(4): 35-37.

[5] 劉春來(lái),文景芝,楊明秀,等.rDNA-ITS在植物病原真菌分子檢測(cè)中的應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,38(1): 101-106.

[6] Xin Z G,Velten J P,Oliver M J,et al.High-throughput DNA extraction method suitable for PCR[J].BioTechniques,2003,34(4): 820-826.

[7] Ioos R,Laugustin L,Rose S,et al.Development of a PCR test to detect the downy mildew causal agentPlasmoparahalstediiin sunflower seeds[J].Plant Pathology,2007,56: 209-218.

[8] Tooley P W,Bunyard B A,Carras M M,et al.Development of PCR primers from internal transcribed spacer region 2 for detection ofPhytophthoraspecies infecting potatoes[J].Applied and Environmental Microbiology,1997,63(4): 1467-1475.

[9] 劉春來(lái),楊明秀,文景芝.大豆疫霉菌ITS分子檢測(cè)程序的建立及其應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào),2007,34(6): 1158-1162.

EstablishmentandapplicationofPCRfordetectionofPlasmoparaviticola

Qin Wentao, Huang Xiaoqing, Kong Fanfang, Wang Zhongyue, Zhang Hao

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

This study designed a pair of primers F-Pv/R-Pv forPlasmoparaviticoladetection based on the differences among sequenced and reportedcox2 gene sequences ofP.viticola.Totally 30kinds of plant pathogens,including 15 kinds of fungi belonging toPlasmoparaand 8 kinds of grape pathogens,were screened to validate the primers F-Pv/R-Pv.The results showed that the primers F-Pv/R-Pv were of high specificity,and only a single product of about 600bp was amplified fromP.viticolagenomic DNA.The sensitivity of the detection was 3.3pg/μL genomic DNA per 20μL PCR reaction volume.Genomic DNAs of 78 samples from different grape plantation areas in China were specifically detected by PCR assay with F-Pv/R-Pv,suggesting that this method was applicable to a wide scope with 100% detection accuracy rate.

Plasmoparaviticola;cox2; PCR; detection

2013-04-12

：2013-05-07

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203035)；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)基金(nycytx-30)

S 436.631

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.019

致謝：Aleksandra Bulajic、Renaud IOOS、Tim Schubert、Otmar Spring等教授為本研究提供了寶貴的參照菌株DNA，國(guó)家葡萄產(chǎn)業(yè)

技術(shù)體系許多綜合試驗(yàn)站為本研究提供了葡萄霜霉病樣品，在此一并表示感謝！

* 通信作者 Tel：010-62815926，E-mail: wangzhy0301@sina.com； Tel：010-62815613，E-mail: hzhang@ippcaas.cn