油茶炭疽病拮抗細(xì)菌Y13主要抑菌物質(zhì)分離純化及作用方式

孟慶敏，周國英，劉君昂，左 杰，董文統(tǒng)，王瑞芹

(中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004)

油茶炭疽病拮抗細(xì)菌Y13主要抑菌物質(zhì)分離純化及作用方式

孟慶敏，周國英，劉君昂*，左 杰，董文統(tǒng)，王瑞芹

(中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004)

油茶內(nèi)生拮抗細(xì)菌Y13是一株對(duì)油茶炭疽病菌有較強(qiáng)抑制作用的枯草芽胞桿菌。為了確定其抑菌物質(zhì)的成分組成及其對(duì)油茶炭疽病菌的作用方式，本文通過乙醇沉淀、固相萃取、反相高效液相色譜法及LC-MS對(duì)抑菌物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定。一共分離純化出16個(gè)活性組分，保留時(shí)間在10.5～26.0min的8個(gè)組分對(duì)于油茶炭疽病菌產(chǎn)生明顯的抑菌圈，其中保留時(shí)間為11.0min處的色譜峰抑菌效果最強(qiáng)，經(jīng)質(zhì)譜初步鑒定確定該化合物的分子量為1042.56u；保留時(shí)間在27.5～39.5 min的8個(gè)組分導(dǎo)致油茶炭疽病病原菌菌絲顏色加深，其中以保留時(shí)間37.5 min處的色譜峰效果最為明顯，質(zhì)譜鑒定該化合物的分子量為1480.85 u。顯微觀察發(fā)現(xiàn)它們通過導(dǎo)致菌絲斷裂、畸形、原生質(zhì)凝集的方式抑制菌絲生長(zhǎng)；通過使孢子畸形、膨大、消融而抑制孢子萌發(fā)。

油茶炭疽病； 拮抗細(xì)菌； 抑菌物質(zhì)； 分離純化； 作用方式

油茶是中國特有木本油料植物，油茶茶籽及其副產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高[1]，但近幾年來隨著油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，油茶病蟲害日趨嚴(yán)重，特別是油茶炭疽病嚴(yán)重影響了油茶的產(chǎn)量和品質(zhì)。油茶炭疽病引起的油茶落果率通常在20%～40%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)60%以上[2-3]。由于化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，不僅嚴(yán)重污染了環(huán)境，同時(shí)也使油茶植株產(chǎn)生了抗藥性，因此油茶病蟲害的生物防治已成為當(dāng)前亟待解決的重大問題。

本研究前期已從健康油茶葉片中篩選出對(duì)油茶炭疽病有強(qiáng)烈抑制作用的油茶內(nèi)生細(xì)菌Y13，經(jīng)生理生化分析及16S rDNA鑒定油茶內(nèi)生菌Y13為枯草芽胞桿菌[4]。對(duì)于枯草芽胞桿菌所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)目前已經(jīng)有了大量研究?？莶菅堪麠U菌可以產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，其中主要包括兩大類：一類是由核糖體途徑合成的肽類抗生素如枯草菌素(subtilosin)[5]、酶類[6]和少量的抗菌蛋白等[7]，另一類是由非核糖體途徑合成的脂肽類抗生素如表面活性素(surfactin)[8]、伊枯草菌素(iturin)[9]和豐產(chǎn)素(fengycin)[10]等?？莶菅堪麠U菌抑菌物質(zhì)主要是通過溶解病原真菌的細(xì)胞壁，從而使原生質(zhì)泄露，菌絲斷裂等[11]。為了明確油茶內(nèi)生細(xì)菌Y13所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的成分及結(jié)構(gòu)，本研究首先對(duì)油茶內(nèi)生菌Y13產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進(jìn)行了分離純化，為之后的質(zhì)譜結(jié)構(gòu)鑒定奠定良好的基礎(chǔ)。同時(shí)本研究也對(duì)抑菌物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲和孢子的影響做了顯微觀察，為以后抑菌機(jī)理的深入研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

1.1.1 拮抗細(xì)菌

枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)Y13為中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室森林微生物菌種保藏室分離保存。

1.1.2 指示病原菌

油茶炭疽病病原菌(Colletotrichumgloeosporioides)為中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室森林微生物菌種保藏室分離保存。

1.1.3 Y13發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖1.5%，酵母膏1.0%，牛肉膏0.3%，氯化鈉1.5%，蒸餾水1000mL，pH7.0。NB培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5%，蒸餾水1000mL，pH7.2～7.4。

1.2 Y13發(fā)酵液抑菌物質(zhì)分離

1.2.1 油茶內(nèi)生菌Y13發(fā)酵液制備

從斜面培養(yǎng)基中挑取一環(huán)Y13菌體接入NB液體培養(yǎng)基中，30℃，140r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h，配制成Y13發(fā)酵液。4 ℃，15 000r/min，離心30min，去掉沉淀，用0.22 μm的濾膜過濾發(fā)酵上清液，得到無菌濾液，即為抑菌物質(zhì)粗提物。

1.2.2 乙醇沉淀法分離抑菌物質(zhì)

向無菌濾液中加入無水乙醇至濃度依次為40%、60%、70%、80%、90%，4 ℃靜置4 h，然后4 ℃，20000r/min，離心30min，保留上清液。對(duì)上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮除去乙醇，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 濾紙片法對(duì)各濃度提取物作抑菌活性檢測(cè)

取油茶炭疽病病原菌餅接入PDA液體培養(yǎng)基中，30℃，160r/min，恒溫振蕩96h，制成油茶炭疽病病原菌發(fā)酵液，從中吸取300μL于PDA固體培養(yǎng)基中，涂布均勻。用100μL無菌水溶解提取物，吸取各個(gè)濃度的乙醇提取物20μL分別滴在濾紙片上，以無菌發(fā)酵上清液為對(duì)照，28 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h，測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3 Y13抑菌物質(zhì)純化

1.3.1 固相萃取法純化Y13抑菌物質(zhì)

利用C18固相萃取柱對(duì)80%乙醇提取物進(jìn)行固相萃取分離，先收集不被吸附的組分，再分別以45%甲醇、65%甲醇、95%甲醇作為萃取劑，分別收集每個(gè)濃度萃取劑所洗脫下來的組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除組分中的甲醇，以無菌發(fā)酵上清液為對(duì)照，通過濾紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。將活性最強(qiáng)的組分干燥濃縮，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 HPLC純化Y13抑菌物質(zhì)

將活性最強(qiáng)的組分先用20%甲醇溶解，再用0.45 μm的有機(jī)系濾膜過濾，通過制備型C18(4.6mm×250mm，5 μm)色譜柱進(jìn)行純化。流動(dòng)相為含0.1%三氟乙酸的甲醇(A)和超純水(B)。用43%～95%甲醇進(jìn)行梯度變速洗脫，進(jìn)樣量為30μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。收集每個(gè)色譜峰組分，將各收集液干燥濃縮，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 HPLC純化后各組分抑菌活性檢測(cè)

將初步純化后的所有活性組分所對(duì)應(yīng)的色譜峰做積分處理，分別用20%甲醇溶解所有樣品，最終使各組分的濃度一致。以20%甲醇為對(duì)照，每個(gè)組分吸取20μL進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)并測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.4 HPLC參數(shù)優(yōu)化

用0.45 μm的有機(jī)系濾膜過濾活性組分，改用流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為超純水，流動(dòng)相A和B中均加有0.1%的三氟乙酸，流速為0.7 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，梯度洗脫。

1.4 Y13抑菌物質(zhì)對(duì)油茶炭疽病菌的作用方式

1.4.1 抑菌物質(zhì)對(duì)油茶炭疽病菌菌絲形態(tài)的影響

分別選取抑菌圈最大的一個(gè)組分和變色圈最大的一個(gè)組分，用接種環(huán)挑取它們與炭疽病菌菌塊交界處的菌絲于顯微鏡下觀察。以正常生長(zhǎng)的菌絲作為對(duì)照。

1.4.2 抑菌物質(zhì)對(duì)油茶炭疽病菌孢子萌發(fā)的影響

采用載玻片懸滴培養(yǎng)法，取正常的油茶炭疽病菌孢子于載玻片上，向其中分別滴加已用無菌水溶解后的抑菌圈最大的組分和變色圈最大的組分，以滴加無菌水的孢子作為對(duì)照，室溫放置24 h后于顯微鏡下觀察。

1.5 Y13主要抑菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定

采用美國熱電LTQ velos pro型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)Y13產(chǎn)生的主要抑菌物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。采用 SAS 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。當(dāng)P<0.05 時(shí)，表示差異顯著；當(dāng)P>0.05 時(shí)，表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Y13發(fā)酵液抑菌物質(zhì)分離

抑菌結(jié)果表明，各濃度乙醇提取物均有抑菌效果。方差分析表明，乙醇濃度對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響達(dá)到顯著性差異(P<0.05)，說明乙醇濃度的高低直接影響了抑菌物質(zhì)活性的強(qiáng)弱。

對(duì)乙醇提取物抑菌活性進(jìn)行差異性分析，見表1。從中可以看出80%乙醇提取物的抑菌效果最強(qiáng)，明顯高于其他濃度提取物的抑菌活性。通過LSD法進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)80%乙醇提取物的抑菌圈直徑最大，活性最強(qiáng)，與其他所有處理組的抑菌活性均有顯著性差異，說明此抑菌物質(zhì)最易被80%乙醇提取出來，因此將80%作為乙醇的最佳提取濃度。

表1乙醇提取物抑菌活性的差異性分析1)

Table1Differenceanalysisofinhibitoryeffectofantimicrobialsubstancespurifiedbyethanolprecipitation

乙醇濃度/%Theconcentrationofethanol抑菌圈直徑/mmThediameterofinhibitionzone40(14．50±1．05)cd60(16．50±1．05)bc70(15．50±1．98)c80(19．50±1．05)a90(12．67±0．52)dCK(17．33±2．25)b

1)采用LSD法進(jìn)行多重比較分析，同列數(shù)值后具有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。表中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 Values in each column followed by different letters are significantly different at 5% level by Duncan’s mean value test.The data are shown as Mean±SD.

2.2 Y13抑菌物質(zhì)純化

2.2.1 固相萃取法純化抑菌物質(zhì)

抑菌結(jié)果表明，只有不被吸附在固相萃取柱上的組分沒有抑菌活性，其他組分均有明顯抑菌效果，其中65%甲醇洗脫組分的抑菌效果最強(qiáng)(見表2)。65%甲醇洗脫組分與其他組分的活性均有顯著性差異。

表2固相萃取抑菌物質(zhì)的抑菌活性1)

Table2Theinhibitoryactivityofantimicrobialsubstancepurifiedbysolid-phaseextraction

甲醇濃度/%Theconcentrationofmethanol抑菌圈直徑/mmThediameterofinhibitionzone0―45(20．17±0．75)b65(29．50±3．21)a95(18．33±1．75)bCK(20．17±0．75)b

1)采用LSD法進(jìn)行多重比較分析，同列數(shù)值后字母不相同表示差異顯著(P<0.05)。表中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 Values in each column followed by different letters are significantly different at 5% level by Duncan’s mean value test.The data are shown as Mean±SD.

2.2.2 高效液相色譜法純化抑菌物質(zhì)

經(jīng)過43%～95%乙腈進(jìn)行梯度洗脫后得到20個(gè)主要的色譜峰，見圖1。

2.2.3 HPLC純化后各組分抑菌檢測(cè)結(jié)果

20個(gè)主要色譜峰抑菌結(jié)果如圖2所示。主要可以分為兩大類，其中前8個(gè)洗脫峰組分是一類抑菌物質(zhì)，它們主要產(chǎn)生明顯的抑菌圈。9號(hào)到16號(hào)組分可以產(chǎn)生明顯的變色圈，使指示菌菌絲的顏色明顯加深，變黑。而17～20號(hào)無任何抑菌效果。

對(duì)各個(gè)組分產(chǎn)生的抑菌圈直徑和變色圈直徑進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果如圖3所示，在產(chǎn)生明顯抑菌圈的前8個(gè)組分中，1號(hào)的抑菌活性最強(qiáng)，其次為3號(hào)組分，5號(hào)組分最弱，72 h后5號(hào)組分幾乎完全失活，分析原因可能是由于濃度較低導(dǎo)致。在9～16號(hào)組分中，14號(hào)組分所產(chǎn)生的變色圈最大，其導(dǎo)致菌絲顏色加深的效果最為明顯。

2.2.4 HPLC參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

通過一系列的色譜條件優(yōu)化后，使保留時(shí)間在29.5～35.0min期間的色譜峰達(dá)到一定的分離效果，符合質(zhì)譜鑒定的要求，結(jié)果見圖4。

2.3 Y13主要抑菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)初步鑒定

利用ITMS對(duì)保留時(shí)間為11.0min和37.5 min的兩個(gè)化合物分別做質(zhì)譜解析，結(jié)果見圖5和圖6。圖5中檢測(cè)到[M+H ]+的m/z為1043.56，因此確定該物質(zhì)的分子量為1042.56u。圖6中檢測(cè)到[M+H ]+的m/z為1481.85，因此確定此物質(zhì)的分子量是1480.85 u，查閱文獻(xiàn)分析對(duì)比，確定前者為iturin同系物，后者為fengycin同系物。

圖1 反相HPLC純化抑菌物質(zhì)Fig.1 Purification of antimicrobial substance by RP-HPLC

圖2 各組分對(duì)油茶炭疽病菌的作用效果Fig.2 The inhibitory effect of the peak fractions on Colletotrichum gloeosporioides

圖3 抑菌物質(zhì)對(duì)油茶炭疽病菌的抑制作用Fig.3 The inhibitory effect of antimicrobial substance on C.gloeosporioides

圖4 優(yōu)化后高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram after optimization

圖5 保留時(shí)間為11.0min處化合物的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.5 The mass spectrum at retention time 11.0min

圖6 保留時(shí)間為37.5 min處化合物的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 The mass spectrum at retention time 37.5 min

2.4 Y13抑菌物質(zhì)對(duì)油茶炭疽病菌的作用方式

2.4.1 抑菌物質(zhì)對(duì)油茶炭疽病菌菌絲形態(tài)的影響

顯微鏡下觀察油茶炭疽病菌經(jīng)兩類主要抑菌物質(zhì)處理前后，菌絲形態(tài)的變化見圖7。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，油茶炭疽病菌的正常菌絲形狀較規(guī)則，細(xì)長(zhǎng)，原生質(zhì)分布均勻。而經(jīng)1號(hào)抑菌物質(zhì)處理后菌絲形狀發(fā)生扭曲，菌絲多處發(fā)生了斷裂及纏繞。而14號(hào)抑菌物質(zhì)導(dǎo)致菌絲扭曲變形且菌絲節(jié)間變粗。因此這兩類抑菌物質(zhì)均抑制菌絲的生長(zhǎng)。

圖7 抑菌物質(zhì)處理油茶炭疽病菌菌絲形態(tài)的顯微觀察Fig.7 Microscope observation of the mycelial morphology of C.gloeosporioides treated with antimicrobial substance

2.4.2 抑菌物質(zhì)對(duì)油茶炭疽病菌孢子的影響

顯微鏡下觀察油茶炭疽病菌孢子見圖8。正常孢子的形狀很規(guī)則，呈扁平狀，長(zhǎng)而細(xì)。經(jīng)1號(hào)抑菌組分處理后的大多數(shù)孢子破裂，形狀不規(guī)則且混成一片。14號(hào)抑菌組分處理后的孢子明顯變得短小而粗大，其破壞程度相對(duì)于1號(hào)處理組較輕，但仍抑制了孢子的萌發(fā)。因此兩類抑菌物質(zhì)均可以導(dǎo)致孢子破碎，抑制其萌發(fā)。

圖8 抑菌物質(zhì)處理油茶炭疽病菌孢子形態(tài)的顯微觀察Fig.8 Microscope observation of C.gloeosporioides spores treated with antimicrobial substance

3 結(jié)論與討論

目前對(duì)于枯草芽胞桿菌抑菌物質(zhì)的研究已有相關(guān)報(bào)道。枯草芽胞桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要為脂肽類抗生素、細(xì)菌素及少量的抗菌蛋白[5，12-15]。裴韜等[16]利用鹽析、透析以及離子交換層析相結(jié)合的方法對(duì)枯草芽孢桿菌P72進(jìn)行分離純化，最終得到對(duì)小麥赤霉病菌有很強(qiáng)抑制能力的抗菌蛋白。沈錦玉等[17]通過濃鹽酸沉淀、乙醇抽提、離子交換層析和高效液相色譜法對(duì)枯草芽胞桿菌B115進(jìn)行分離純化，最終得到分子量為803.6Da的抑菌物質(zhì)。

本試驗(yàn)主要采用乙醇沉淀、SPE固相萃取以及反相高效液相法得到Y(jié)13代謝物中的抑菌物質(zhì)。經(jīng)離子阱質(zhì)譜初步檢測(cè)，確定保留時(shí)間在11.0min和37.5 min處的化合物的主要離子峰的質(zhì)荷比分別為1043.56和1481.85。Chen等[18]從枯草芽胞桿菌JA中分離純化出主要的活性物質(zhì)，并通過ESI-MS分析鑒定出質(zhì)荷比為1043.4的物質(zhì)為iturin同系物。因此確定本試驗(yàn)中質(zhì)荷比為1043.56的物質(zhì)為iturin同系物。楊琦瑤等[19]從對(duì)辣椒疫霉病菌有強(qiáng)烈抑制作用的枯草芽胞桿菌菌株B006的發(fā)酵液中提取出主要成分，經(jīng)質(zhì)譜鑒定質(zhì)荷比為1436、1450、1478和1492的物質(zhì)為fengycin同系物，而本研究中質(zhì)荷比為1481.85的物質(zhì)與報(bào)道中物質(zhì)相差不多，推斷應(yīng)為相差若干個(gè)亞甲基的fengycin同系物。具體同系物結(jié)構(gòu)目前正在解析當(dāng)中，有望發(fā)現(xiàn)新的同系物結(jié)構(gòu)。

通過顯微觀察確定抑菌物質(zhì)作用方式。對(duì)抑菌物質(zhì)處理后的菌絲和孢子進(jìn)行鏡檢，結(jié)果表明這些抑菌物質(zhì)可以溶解油茶炭疽病菌的細(xì)胞壁從而使原生質(zhì)外漏，導(dǎo)致菌絲斷裂，同時(shí)還可以抑制孢子的萌發(fā)。這些抑菌物質(zhì)對(duì)油茶炭疽病菌的抑制效果較好，是一類有開發(fā)價(jià)值的抗真菌藥物。對(duì)于油茶內(nèi)生菌Y13所產(chǎn)抑菌物質(zhì)目前未見報(bào)道，本試驗(yàn)共純化出16個(gè)抑菌組分，為了進(jìn)一步確定這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分，目前正在進(jìn)行質(zhì)譜解析，希望通過了解抑菌物質(zhì)的具體結(jié)構(gòu)，為今后從代謝調(diào)控方面深入研究其抑菌機(jī)理提供有力支持。

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IsolationandpurificationofantimicrobialsubstanceproducedbyendophyticbacteriaY13intheCamelliaanditsinhibitoryeffectonCamelliaanthracnose

Meng Qingmin，Zhou Guoying，Liu Jun’ang，Zuo Jie，Dong Wentong，Wang Ruiqin

(KeyLaboratoryoftheMinistryofEducationforNon-timberProductForestSilvicultureandProtection，CentralSouthUniversityofForestry﹠Technology，Changsha410004，China)

Bacillussubtilisstrain Y13isolated fromCamelliahas strong inhibitory activity againstColletotrichumgloeosporioides.In order to identify the antimicrobial compounds and the inhibition mechanism againstC.gloeosporioides,the antimicrobial substances were isolated and purified by ethanol precipitation,solid phase extraction and reversed phase high performance liquid chromatography.Antifungal activity assay indicated that 16main peak fractions had inhibition activity.The 16main peak fractions can be divided in two groups.One group at retention time from 10.5 min to 26.0min showed inhibition activity.The peak fraction at retention time 11.0min showed the strongest activity and the molecular weight was 1042.56u identified by LC-MS.The other group at retention time from 27.5 min to 39.5 min dark the mycelia ofC.gloeosporioides.The compound at retention time 37.5 min showed the strongest activity and the molecular weight was 1480.85 u.Microscope observation revealed that the 2 compounds could break up and enlarge the mycelia,deform and swell the spores,and inhibit the spore germination.

Camelliaanthracnose; antagonistic bacteria; antimicrobial substance; isolation and purification; inhibition mechanism

2013-09-22

：2013-12-02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170598)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CX2013B356)；中南林業(yè)科技大學(xué)研究生科技創(chuàng)新資助項(xiàng)目(CX2013B25)

S 435.65， S 476.8

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.007

* 通信作者 Tel: 0731-85623131； E-mail: kjc9620@163.com