牦牛LEPR 基因第4 外顯子PCR-SSCP 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

茍紅晶

(甘肅省慶陽(yáng)市畜牧技術(shù)推廣中心，745000)

1 前言

瘦素受體基因（leptin receptor，LEPR）可直接或間接地影響下丘腦-垂體-性腺軸的功能，對(duì)黃體生成素釋放激素、促卵泡素和黃體生成素的釋放呈現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)。因此，近年來(lái)有關(guān)家畜LEPR基因多態(tài)性和基因突變的研究已成為熱點(diǎn)之一。SSCP是目前分析單核苷酸多態(tài)性（SNPs）較為有效、簡(jiǎn)單的方法之一。

1989年Orita等提出了SSCP的概念,并將此法用于檢測(cè)復(fù)雜基因組單拷貝DNA中的多態(tài)現(xiàn)象。1992年,Hoshino等對(duì)SSCP分析法又作了大膽改進(jìn),PCR-SSCP分析法從此確立。由于它具有檢測(cè)靈敏性高，操作簡(jiǎn)單，技術(shù)容易掌握，實(shí)驗(yàn)成本低，適合于大量樣品的篩選，對(duì)DNA原材料純度要求不高，所需量少等優(yōu)點(diǎn)，因此目前被廣泛用于基因突變的檢測(cè)，包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失[1]。 其缺點(diǎn)是許多因素都會(huì)影響SSCP的分析結(jié)果，基因的差異、片段的大小都會(huì)造成其分析條件的變化，難以有一個(gè)相對(duì)固定的分析條件，需要試驗(yàn)人員不斷地探索。影響該技術(shù)成功的主要因素有PCR的特異性、凝膠濃度、聚丙烯酰胺的交聯(lián)度、甘油、電泳溫度及時(shí)間等[2-3]。此外，PCR產(chǎn)物與變性上樣緩沖液的比例、上樣量、電壓、電泳緩沖液的離子濃度亦影響試驗(yàn)結(jié)果[4]。因此，本試驗(yàn)以牦牛LEPR基因第4外顯子為研究對(duì)象，在前期對(duì)該片段PCR條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，就凝膠濃度、交聯(lián)度、電泳時(shí)間等影響SSCP分析結(jié)果的因素進(jìn)行優(yōu)化，以期準(zhǔn)確建立牦牛LEPR基因的PCR-SSCP條件，為進(jìn)行牦牛LEPR基因多態(tài)性分析奠定良好的基礎(chǔ)，同時(shí)為其他基因PCR-SSCP最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件的建立提供參考。

2 材料與方法

2.1血樣來(lái)源

于2013年9月在甘南州碌曲縣李洽如牧場(chǎng)采集牦牛血樣165份，每頭牦牛頸靜脈采取新鮮血液10 mL，按抗凝劑與血液體積比1：5加入ACD抗凝，保存于-70℃。

2.2主要試劑

蛋白酶K、Tris飽和酚、丙烯酰胺、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、TEMED、Tris堿、EDTA，過(guò)硫酸銨為進(jìn)口藥品；PCR過(guò)程中所需的DNA Taq酶，dNTP購(gòu)自大連寶生物公司；乙酸、乙醇、甲醛，硝酸銀等均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自蘭州鵬程生物公司。

2.3基因組DNA提取

牦?；蚪MDNA制備用常規(guī)酚/氯仿提取，并將提取的DNA置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

參考Yikun Guo[5]等設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增LEPR基因第4外顯子,引物由大連寶生物公司合成，引物序列上游為5′-ACTGTTGCCTCATTGTCT-3′，下游為5′-TAGGCACAACTTACCAAC-3′。反應(yīng)體系：本試驗(yàn)PCR擴(kuò)增采用20μL反應(yīng)體系，其中ddH2O 15.2μL，10×Buf fer 2.0μL，dNTP混合物（濃度2.5 mM）0.3μL，引物（濃度10 pM）0.75μL，DNA模板（濃度50～150 ng）0.8μL，Taq酶（濃度5.0 U/μL）0.20μL。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；55 oC退火30 s；72℃延伸45 s,共37個(gè)循環(huán)，最后在72℃終延伸10 min，4℃保存。

2.5 SSCP條件

2μL PCR產(chǎn)物和8μL加樣緩沖液（98%甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯氰、10 mmol·L-1 EDTA(pH8.0、10%甘油）混勻，98℃變性10 min，然后冰浴10 min，使之保持變性狀態(tài)，最后點(diǎn)樣電泳。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)和分析了影響SSCP最重要的4個(gè)因素--凝膠濃度、交聯(lián)度、電泳時(shí)間和甘油的添加程度。其中凝膠濃度分別為8.0%、10.0%和12.0%，交聯(lián)度分別為29：1、39：1和49：1，電泳時(shí)間分別為15 h、20 h和25 h（見(jiàn)表1），甘油有添加和不加兩種情況，使用的電泳槽膠板實(shí)際規(guī)格為:170 mm×170 mm×1.5 mm。以200 V電壓在17℃（采用冷循環(huán)系統(tǒng)控溫）1×TBE電泳液中電泳，采用Car los銀染色法銀染顯色[6]。

表1 SSCP影響因素的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

3 結(jié)果與分析

3.1牦牛LEPR基因第4外顯子PCR擴(kuò)增圖

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)的引物用于PCR擴(kuò)增都獲得了很好的結(jié)果，片段長(zhǎng)度與預(yù)期大小一致，而且沒(méi)有非特異性擴(kuò)增條帶，可以直接進(jìn)行SSCP檢測(cè)（見(jiàn)圖1）。

3.2牦牛LEPR基因第4外顯子SSCP分析條件的優(yōu)化

3.2.1凝膠濃度

在200V電壓下，17℃電泳液中、交聯(lián)度為29：1時(shí)，采用凝膠濃度分別為8.0%（圖2）、10.0%（圖3）和12.0%（圖4）的凝膠電泳。結(jié)果表明在其他電泳條件不變的情況下，膠濃度為12%的凝膠電泳效果最好。

3.2.2交聯(lián)度

在最佳凝膠濃度的研究中發(fā)現(xiàn)，12%的凝膠濃度電泳效果最好，所以其他實(shí)驗(yàn)條件固定在200V電壓下，17℃電泳液、凝膠濃度12%下。分別使用交聯(lián)度為29：1（圖5）、39：1（圖6）和49：1（圖7）的膠進(jìn)行電泳，分析最佳交聯(lián)度。結(jié)果表明交聯(lián)度為29：1的凝膠電泳效果最好。

3.2.3電泳時(shí)間

在12%的凝膠濃度、29：1的交聯(lián)度下，分別用15 h、20 h和25 h進(jìn)行電泳，結(jié)果表明電泳時(shí)間為25 h時(shí)條帶最為清晰。

3.2.4甘油

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，凝膠中不添加甘油，染色后條帶更清晰。

3.2.5最佳優(yōu)化條件

通過(guò)凝膠濃度、交聯(lián)度、電泳時(shí)間和甘油的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，在200V電壓，17℃電泳液中，12%的凝膠濃度、29：1的交聯(lián)度、不添加甘油和25 h的電泳時(shí)間為牦牛LEPR基因第4外顯子的最佳PCR-SSCP試驗(yàn)條件（圖8）。

4 討論

PCR-SSCP是一項(xiàng)檢測(cè)堿基突變、研究基因多態(tài)性的試驗(yàn)技術(shù)，優(yōu)化SSCP分析條件、準(zhǔn)確地對(duì)待檢樣品進(jìn)行分析是進(jìn)行多態(tài)性研究的前提?，F(xiàn)就影響試驗(yàn)結(jié)果的主要條件如電壓、凝膠濃度、交聯(lián)度、電泳時(shí)間和甘油等因素展開(kāi)討論。

4.1 PCR的質(zhì)量

擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物特異性要好，產(chǎn)量要大。本人在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增的有些PCR產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)時(shí)無(wú)非特異性條帶，但聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于瓊脂糖凝膠電泳，在進(jìn)行SSCP檢測(cè)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)許多雜帶，影響基因型的判斷，嚴(yán)重的致使無(wú)法判斷目的片段，最終得重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。因此，PCR擴(kuò)增的模板的質(zhì)量關(guān)系到SSCP的成敗，是重要的影響因素之一。本研究中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物特異性好，用于SSCP分析獲得了較好的結(jié)果。

4.2溫度和電壓、電泳時(shí)間

電泳溫度是影響單鏈遷移速度和重復(fù)性高低的最關(guān)鍵的因素之一。在具體操作過(guò)程中，應(yīng)自始至終保持電泳溫度的相對(duì)恒定。電泳不恒溫，凝膠散熱快慢也受影響，直接影響到電泳時(shí)凝膠溫度，而凝膠溫度直接影響到單鏈構(gòu)象的變化。凝膠溫度改變，DNA單鏈構(gòu)象也可能發(fā)生相應(yīng)改變，其泳動(dòng)速度也就不同。所以如果不控制凝膠溫度，結(jié)果重復(fù)性差。本試驗(yàn)將電泳裝置與冷循環(huán)系統(tǒng)連接，嚴(yán)格控制了電泳溫度（17℃），所以實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和結(jié)果較好。

電壓和電泳時(shí)間對(duì)SSCP分析的影響，應(yīng)視不同的情況探索。本實(shí)驗(yàn)采用200V電壓電泳，且在有冷卻裝置的電泳槽中進(jìn)行SSCP，所以取得了很好的效果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們得出的經(jīng)驗(yàn)是較低電壓、較長(zhǎng)時(shí)間沒(méi)有壞處，在此基礎(chǔ)上可以適當(dāng)提高電壓，縮短電泳時(shí)間。4.3非變性聚丙烯酰胺凝膠成分

聚丙烯酰胺凝膠成分也是影響SSCP檢出率的因素之一，包括丙烯酰胺和N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺的比例，凝膠濃度、甘油的添加程度等。

凝膠濃度的變化對(duì)于檢出不同長(zhǎng)度片段中單堿基突變的敏感性很重要。其影響在于改變凝膠孔徑及密度而使片段凝膠中的遷移率不同，而對(duì)于單鏈構(gòu)象形成沒(méi)有影響，會(huì)影響單鏈在凝膠中的遷移率而造成對(duì)不同片段的檢出率差異。研究表明，較長(zhǎng)的片段應(yīng)使用較高的凝膠濃度，小片段使用較小的膠濃度，本試驗(yàn)也得出了相同的結(jié)論，用12%的凝膠濃度獲得了較好的結(jié)果。

姜運(yùn)良[7]認(rèn)為對(duì)于較大的片段（≥200bp）一般采用較高交聯(lián)度的凝膠（丙烯酰胺：N，N′-亞甲雙丙烯酰胺=19：1或29：1）；對(duì)于≤200bp的片段則采用較低的交聯(lián)度（丙烯酰胺：N，N′-亞甲雙丙烯酰胺=39：1或49：1）。在本研究中，我們根據(jù)擴(kuò)增片段的大小進(jìn)行了摸索，該片段用29：1的交聯(lián)度，發(fā)現(xiàn)較大的片段用較高的交聯(lián)度，與姜運(yùn)良的觀(guān)點(diǎn)有一致之處。但還是應(yīng)該根據(jù)實(shí)際的情況，制定不同的交聯(lián)度。

對(duì)于添加甘油是否會(huì)影響SSCP檢出率的報(bào)道并不一致。Fukuoko等[8]認(rèn)為凝膠中加入5%的甘油可以提高檢出率，姜運(yùn)良[9]也認(rèn)為對(duì)于100-200 bp范圍內(nèi)的DNA片段，10%-15%凝膠，丙烯酰胺與N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺的比例為29：1時(shí)，凝膠中加入5%的甘油效果最佳。劉佳健等[10]認(rèn)為凝膠中不加甘油的效果較好。在本研究中473bp的片段用29：1的交聯(lián)度加入甘油，難以分辨不同的基因型，而不加甘油時(shí)，分辨率較好。凝膠中是否加甘油，對(duì)單鏈的遷移速度影響很大：有的片段，甘油對(duì)其遷移有促進(jìn)作用，而有的片段，甘油則抑制其遷移，甘油的這種作用機(jī)制目前尚不清楚[11]。所以，凝膠中加不加甘油，如加甘油，多大濃度好，沒(méi)有什么規(guī)律可循，只能靠實(shí)踐來(lái)確定。

5 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明凝膠濃度為12%，交聯(lián)度為29：1，不添加甘油，17℃、1×TBE緩沖液中電泳25 h是牦牛LEPR基因第4外顯子SSCP分析的最佳試驗(yàn)條件。

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