虻蟲活性蛋白聚糖結(jié)構(gòu)中單糖、氨基酸組成及分子量的分析測(cè)定

劉大有,趙 博,蔡廣知,王淑敏,陳迎男,徐 莉,鄧明魯

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),長(zhǎng)春 130117)

中藥虻蟲為虻科昆蟲腹帶虻(TabanusbivittanusMat.)等的雌性蟲體[1]，是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。虻蟲在我國(guó)大部分地區(qū)都有分布，以牧區(qū)居多，資源豐富，但野生采收較為困難，因此研究不多。對(duì)虻蟲的藥用成分和性質(zhì)了解也較少。虻蟲具有逐瘀、破積、通經(jīng)的功效，用于治療癥瘕、少腹蓄血、血滯經(jīng)閉、撲損瘀血等癥，是大黃 蟲丸等中藥成方的主藥之一[1-2]。前人曾對(duì)中藥虻蟲有過化學(xué)及藥理作用研究。楊星勇等[3]從華廣虻(TabanusameanusWalke)中分離純化出纖溶活性蛋白TAFP,及TFC1和TFC2[4]。劉大有[5]對(duì)姚虻(TabanusyaoMacquart)中多糖類成分進(jìn)行了提取和分離，從制備性高效液相分離得到高純度多糖TybⅡ。金偉[6]從爾瘤虻(TabanusnodiferaWang)中分離得到糖胺聚糖TAG。等離子體發(fā)射光譜法對(duì)虻蟲中的微量元素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中含有豐富的微量元素如Fe、Zn、Cr、Mn、Mg、Sr等[7]。芮和愷等[8]采用氣相層析從腹帶虻中分離得到棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸4種有機(jī)酸類化合物。藥理活性研究表明，虻蟲提取物具有延長(zhǎng)動(dòng)物凝血時(shí)間，降低血漿中纖維蛋白原的含量[9]、改善血液流變參數(shù)(減少血漿中纖維蛋白原含量，抑制血小板黏附性，降低全血黏度比、血漿黏度比和降球壓積,減慢血沉速度)[10]、抑制體內(nèi)血栓生成[11]等作用。臨床應(yīng)用其治療血液系統(tǒng)疾病[12-13]，肝病[14-15]，婦科疾病[16-17]及皮膚科疾病等[18]。 本課題在前人研究的基礎(chǔ)上，首次對(duì)虻蟲中寶雞虻(TabanusbaojiensisXu)提取的蛋白聚糖結(jié)構(gòu)中單糖、氨基酸組成及分子量范圍進(jìn)行了研究。為中藥虻蟲蛋白聚糖的應(yīng)用開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)用虻蟲藥材經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院飲片加工廠購(gòu)自安徽亳州，產(chǎn)地為四川，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲教研室史樹森教授鑒定為寶雞虻(TabanusbaojiensisXu)，屬姚虻群。Sartorious BS110S電子天平(德國(guó)sartorious公司生產(chǎn))；DGE 30/14-IIA電熱鼓風(fēng)干燥箱(南京化學(xué)儀器廠生產(chǎn))；UNICAM紫外分光光度計(jì)(美國(guó)熱電儀器集團(tuán)公司生產(chǎn))；RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn))；LGJ-10冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠生產(chǎn))；HYDRASYS自動(dòng)電泳儀(法國(guó)Sebia公司生產(chǎn));Varian3400GC氣相色譜儀(美國(guó)VARIAN公司生產(chǎn))；Agilent1100液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn))；Agilent GC-MS 689015973N氣質(zhì)聯(lián)用分析儀(美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn))。氯化鈉、三氯乙酸、過氧化氫、醋酸鉛、醋酸氨、濃硫酸、碘化鉀、酸性氯化亞錫、碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸 鹽酸、葡萄糖(TLC用)、鼠李糖、阿拉伯糖等，均為北京化工廠生產(chǎn)的分析純?cè)噭?，所用乙?醇沉淀用)為醫(yī)用乙醇。胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡萄糖對(duì)照品(GC用)均為美國(guó)sigma公司生產(chǎn)?？捡R斯亮蘭R.250、電泳凝膠、免磷酸化酶、牛血清蛋白、兔肌動(dòng)蛋白、牛碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制劑、雞蛋清溶菌酶均為瑞典Amersham公司產(chǎn)品。SephadexG-200為瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品。標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白為德國(guó)BOEHRINGER MANHEIMGmbh公司產(chǎn)品?；钚蕴繛樵噭┘?jí)，四川省峨邊華泰活性炭有限責(zé)任公司生產(chǎn)。薄層硅膠預(yù)制板為青島海洋化工廠生產(chǎn)。透析袋為美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)(進(jìn)口分裝)。

2 虻蟲蛋白聚糖制備

虻蟲藥材破碎，以10倍量生理鹽水60 ℃浸漬3次,每次12 h，濾過，濾液60 ℃減壓濃縮至1 g原藥材/mL，加CCl3COOH至終濃度5%，4 ℃靜止24 h，抽濾，濾液加水稀釋至0.2 g原藥材/mL,加H2O2至濃度達(dá)2%，靜止8 h脫色，NaOH調(diào)PH中性，3500分子量截流透析袋常水透析48 h,蒸餾水透析24 h，60 ℃減壓濃縮至0.5 g原藥材/mL,加乙醇至含醇量70%，4 ℃靜止過夜，上清液加乙醇至含醇量90%，4 ℃靜止過夜，過濾收集沉淀部分,60 ℃揮干殘留乙醇，加水稀釋至0.5 g原藥材/mL，-49 ℃冷凍干燥48 h即得。

3 虻蟲蛋白聚糖水解液?jiǎn)翁墙M成測(cè)定

3.1 TLC檢識(shí)

3.1.1 虻蟲蛋白聚糖的水解 樣品30 mg以50 mL 1 mol/L硫酸封管120 ℃水解1 h，加Ba(OH)2調(diào)PH至7，離心，上清液100 ℃水浴揮干。

3.1.2 虻蟲蛋白聚糖水解液薄層檢識(shí) 將水解液揮干所得粉末及單糖對(duì)照品分別用蒸餾水溶解，水溶液依次點(diǎn)于硅膠薄層板后，進(jìn)行展開、顯色。

展開劑：正丙醇∶氨水∶水(60∶40∶5)； 顯色劑：硫酸∶乙醇∶苯酚(0.5 mL∶9.5 mL∶0.3g)； 顯色條件：105 ℃加熱10 min。

結(jié)果：TLC顯示蛋白聚糖水解液中單糖組成為葡萄糖。

3.2 GC檢識(shí)

3.2.1 乙酰化物的制備(糖腈乙?；?[19]稱取2所得干燥粉末及葡萄糖對(duì)照品各10 mg，分別加入鹽酸羥胺8 mg，吡啶0.5 mL，于90 ℃水浴并振蕩，30 min后取出，冷卻至室溫后，加入醋酸酐0.5 mL，90 ℃繼續(xù)加熱30 min乙?；玫揭阴；铩Ｒ阴；餃p壓蒸干，加氯仿2 mL溶解，即得供試液。

3.2.2 乙?；颰LC檢識(shí) 將2所得對(duì)照品、樣品及空白乙?；锫确氯芤?與葡萄糖對(duì)照品、樣品水溶液依次點(diǎn)于硅膠薄層板后，進(jìn)行展開、顯色。(TLC展開劑、顯色劑及顯色條件同2)。

結(jié)果：TLC肉眼觀察原單糖位置無斑點(diǎn)顯色，乙酰化較為完全。

3.2.3 乙?；颎C檢識(shí)

3.2.3.1 氣相色譜條件 氣相色譜柱:SE-54 15 mm×0.22 mm×0.25 μm；氣相柱升溫程序：150 ℃(2 min)→10 ℃/ min 250 ℃→(20 min)；進(jìn)樣口溫度：300 ℃；柱壓：90 kpa；檢測(cè)器：FID(300 ℃)。

3.2.3.2 氣相色譜檢識(shí) 用微量進(jìn)樣器精密吸取0.2 μL 2項(xiàng)所得供試液及對(duì)照品乙?；锫确氯芤鹤⑷霘庀嗌V儀進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1、圖2。

結(jié)論:TLC上虻蟲蛋白聚糖水解液與葡萄糖對(duì)照品溶液斑點(diǎn)位置一致，GC出峰時(shí)間一致，表明虻蟲蛋白聚糖的單糖組成為葡萄糖。

4 虻蟲蛋白聚糖氨基酸組成測(cè)定(HPLC法)

4.1 測(cè)定方法 照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2005版一部,附錄VID)測(cè)定。由于熒光監(jiān)測(cè)器FID對(duì)胱氨酸、賴氨酸不敏感，采用二級(jí)管陣列DAD、FID雙檢測(cè)器。

圖1 葡萄糖對(duì)照品乙?；颎C

圖2 蛋白聚糖水解液干燥產(chǎn)物乙酰化物GC

4.2 HPLC色譜條件 儀器型號(hào)：Agilent 1100；色譜柱：Iorbax EClipse AAA.4.6 mm×75 mm×3.5 μm；流動(dòng)相：A：PH值7.8 NaH2PO4緩沖液，B：乙腈：甲醇：水(45∶45∶10)；檢測(cè)器：DAD二級(jí)管陣列、FID熒光；流速：2 mL/min。對(duì)照品溶液制備：17種Sigma-aldrich氨基酸對(duì)照品配制成2.5 μg/mL蒸餾水溶液。

4.3 樣品水解液制備 稱取虻蟲蛋白聚糖樣品30 mg，置水解管中，加入10 mL 6 mol/L HCl、0.1%巰基乙醇充氮?dú)夂蠓馍w，110 ℃水解24 h。

4.4 水解液氨基酸組成測(cè)定 用微量進(jìn)樣器精密移取各對(duì)照品溶液及虻蟲蛋白聚糖水解液0.2 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖3、圖4(上圖為DAD二級(jí)管陣列檢測(cè)器檢測(cè)結(jié)果,下圖為FID檢測(cè)器檢測(cè)結(jié)果，nva為儀器校正內(nèi)標(biāo))。

對(duì)比虻蟲蛋白聚糖水解液與對(duì)照品出峰時(shí)間，確定水解液中所含氨基酸種類，通過峰面積計(jì)算水解液中各種氨基酸所占百分比，結(jié)果見表1。

結(jié)果：虻蟲蛋白聚糖水解液中共檢測(cè)出天冬氨酸、谷氨酸、纈氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸等16種氨基酸，未發(fā)現(xiàn)胱氨酸。

圖3 氨基酸對(duì)照品HPLC

圖4 樣品水解液HPLC

檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果/(g/100 g)檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果/(g/100 g)天冬氨酸2.23胱氨酸 —谷氨酸 3.19纈氨酸 0.55絲氨酸 0.99蛋氨酸 0.18組氨酸 0.56苯丙氨酸0.34甘氨酸 1.42異亮氨酸0.39蘇氨酸 0.83亮氨酸 0.55精氨酸 1.17賴氨酸 1.22丙氨酸 1.18脯氨酸 0.64酪氨酸 0.47總 和 15.89

5 虻蟲蛋白聚糖分子量范圍測(cè)定

5.1 電泳測(cè)定

5.1.1 電泳條件 SOD.PAGE分析:Laemmi法，不連續(xù)膠系統(tǒng)，5%濃縮膠，15%分離膠，考馬斯亮蘭R.250顯色，marker為Amersham公司出品。

5.1.2 虻蟲蛋白聚糖分子量測(cè)定 分別將待測(cè)樣及對(duì)照品以蒸餾水配制成各1 mg/mL的溶液，于凝膠上進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖5。

結(jié)果：電泳結(jié)果顯示虻蟲蛋白聚糖分子量范圍約為8 000～35 000。

5.2 sephadex G-200凝膠柱測(cè)定

5.2.1 sephadex柱層析條件 sephadexG-200為Pharmacia公司產(chǎn)品，蒸餾水浸泡24 h充分溶脹后裝柱，凝膠柱1.5 cm×97 cm，蒸餾水洗脫，流速1 mL/min。

5.2.2 藥液配制 不同分子量對(duì)照品及虻蟲蛋白聚糖樣品以蒸餾水配制成1 mg/mL的溶液后上柱。

5.2.3 測(cè)定方法 不同分子量對(duì)照品依次上柱,自流下第一滴洗脫液開始計(jì)算洗脫體積，每管3 mL收集洗脫液，直至酚-硫酸顯色反應(yīng)呈陽性為止，記錄各自從凝膠柱上洗脫的體積。蘭葡聚糖凝膠(分子量2,000,000)上柱測(cè)得其洗脫體積Vo=71.5 mL，此即水體積。不同分子量對(duì)照品上柱測(cè)定洗脫體積Ve。結(jié)果見表2。

結(jié)果：計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=-0.805X+5.560 5(r=0.992 5)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6所示。

圖6 對(duì)照品凝膠柱洗脫標(biāo)準(zhǔn)曲線

虻蟲蛋白聚糖水溶液上柱洗脫，洗脫液不經(jīng)顯色于280 nm處得吸光度A2(圖14中系列2)，洗脫液按酚-硫酸法顯色，于490 nm處測(cè)得吸光度A1，結(jié)果見表3。

表3 sephadex凝膠柱洗脫體積與吸光度

按表3繪制樣品洗脫圖如圖7。

圖7 樣品洗脫圖

結(jié)果：多糖類物質(zhì)洗脫體積為135～168 mL,蛋白類物質(zhì)洗脫體積為138～165 mL。 結(jié)論：洗脫體積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算求得虻蟲蛋白聚糖分子量范圍為(1.03～3.92)×104。多糖類物質(zhì)洗脫體積與蛋白類物質(zhì)洗脫體積基本一致，證明所得提取物為蛋白與大分子糖類結(jié)合而成的蛋白聚糖。

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