應(yīng)用微衛(wèi)星PCR技術(shù)鑒別中國林蛙

蔡廣知，鄭 丹，張彥飛，貢濟宇

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

微衛(wèi)星DNA指紋圖譜(microsatellite，MS)又稱為短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeats，STR)或簡單序列重復(fù)(simple sequnce repeat，SSR)，是基因組中一段由幾十個核苷酸組成的序列，此序列一般由幾個核苷酸(一般為2～4個)為單位多次串聯(lián)重復(fù)組成[1-2]。其中以雙核苷酸重復(fù)最為常見，真核生物的基因組中有大量的微衛(wèi)星DNA存在,約每隔10～550 kb就存在一個微衛(wèi)星。微衛(wèi)星DNA由于具有特異性的PCR擴增、多態(tài)信息容量高、引物通用性好、突變率高、共顯性等特點[3-4]。本文采用微衛(wèi)星鑒別技術(shù)，對長白山、黑龍江伊春、遼寧撫順、吉林四海林場4個地區(qū)的林蛙開展了鑒別研究。

1 材料

1.1 儀器 1110型PCR儀(美國Bio-Rad公司);TGL型臺式高速離心機(湖南星科科學(xué)儀器有限公司)；Dolphin-Doc凝膠成像分析儀(美國wealtec公司);JY-SP10水平電泳槽(杭州匯爾儀器公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；微型離心機(北京六一儀器有限公司)；PCF型超純水機(成都品成科技有限公司)。

1.2 試劑及耗材 DL500 Marker購自寶生物工程有限公司；熒光染料(EB)和單染料購于天根生化科技有限公司；50XTAE緩沖液和瓊脂糖均購自上海生工生物工程有限公司；PCR mix(英杰生命科技有限公司);DNA提取試劑盒編號SK-8222和動物組織快速直接PCR試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司。

2 方法

2.1 PCR的反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)體系為25 μL:PCR反應(yīng)液為12.5 μL(1 x),模板為0.5 μL(0.1～10 ng)，引物為上下游引物各1 μL(0.4 μmol/L)，超純水10 μL，PCR反應(yīng)程序以正品長白山野生林蛙為模板。

2.2 PCR反應(yīng)程序 95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性50 s；46～60 ℃退火50 s；72 ℃延伸90 s；共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min；8 ℃保存。

2.3 特異性鑒別引物的篩選 根據(jù)GenBank發(fā)表的中國林蛙的基因序列,以及國內(nèi)外文獻的報道，選出11對微衛(wèi)星引物作為本實驗的引物，最終有5對能夠穩(wěn)定擴增：

引物1：RCMS035 F:AATGGCGAGGAGGTTGACTA

EU377559 R:GCAGTGTTTTATCGCTCGGT

引物2：RCMS042 F:TCTAGCCAGCAGGTAAAACTC

EU377560 R:GAAGTTTGTTCTATTGACCTCTGT

引物3：RCMS092 F:CAAAAGCAGATGGCTGGATAC

EU377562 R:GCTCTATGATAGTGCGTGAAGG

引物4：RCMS029 F:CTATGGACAGAGCAGAAAGAC5

EU377556 R:GCATCTGCTGGTTGGGTAGTG

引物5：RCMS030 F:ACAGGGCAGGACATCTCAGC

EU377557 R:GCATGGGACAAGATACTGGC

3 結(jié)果

3.1 5引物對不同地區(qū)林蛙的PCR電泳圖譜分析

3.1.1 引物1的PCR電泳圖譜分析 提取4種林蛙DNA模板，加入引物1，退火溫度為52.8 ℃，模板濃度為0.5 μL，循環(huán)次數(shù)為35個循環(huán)，擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳電壓為120 V，電泳時間為35 min，上樣量為0.5 μL，在全自動凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察和分析。由擴增后的電泳圖可以看出，長白山林蛙在240 bp左右有明顯的擴增條帶，黑龍江伊春的林蛙在200 bp處有明顯的擴增條帶，遼寧撫順林蛙在179 bp處有明顯的擴增條帶，吉林四海林場林蛙在220 bp處有明顯的擴增條帶。

3.1.2 引物2的PCR電泳圖譜分析 提取4種林蛙DNA模板，加入引物2,退火溫度為55 ℃，后續(xù)操作同引物1。結(jié)果表明，長白山林蛙在120 bp左右有明顯的擴增條帶,黑龍江伊春的林蛙在165 bp處有明顯的擴增條帶，遼寧撫順林蛙在135 bp處有明顯的擴增條帶，吉林四海林場林蛙在150 bp處有明顯的擴增條帶。

3.1.3 引物3的PCR電泳圖譜分析 提取4種林蛙DNA模板，加入引物3進行擴增，其退火溫度為57 ℃，后續(xù)操作同引物1。結(jié)果表明，長白山林蛙在200 bp左右有明顯的擴增條帶，黑龍江伊春的林蛙在150 bp處有明顯的擴增條帶，遼寧撫順林蛙在190 bp處有明顯的擴增條帶，吉林四海林場林蛙在230 bp處有明顯的擴增條帶。

3.1.4 引物4的PCR電泳圖譜分析 提取4種林蛙DNA模板，加入引物4進行擴增，其退火溫度為57 ℃，后續(xù)操作同引物1。結(jié)果表明，長白山林蛙在280 bp左右有明顯的擴增條帶，黑龍江伊春的林蛙在180 bp處有明顯的擴增條帶，遼寧撫順林蛙在210 bp處有明顯的擴增條帶，吉林四海林場林蛙在245 bp處有明顯的擴增條帶。

3.1.5 引物5的PCR電泳圖譜分析 提取4種林蛙DNA模板，加入引物5進行擴增，其退火溫度為55 ℃，后續(xù)操作同引物1。結(jié)果表明，長白山林蛙在280 bp左右有明顯的擴增條帶，黑龍江伊春的林蛙在180 bp處有明顯的擴增條帶，遼寧撫順林蛙在200 bp處有明顯的擴增條帶，吉林四海林場林蛙在300 bp處有明顯的擴增條帶。

3.2 微衛(wèi)星等位基因分型 對上述5對引物的正向引物5’端用熒光標記進行修飾，分別進行40只林蛙樣本的動物DNA提取，根據(jù)上述PCR條件進行等位基因擴增。PCR產(chǎn)物應(yīng)用ABI 3730自動測序儀分型進行等位基因測試；并用GeneMapper ID v3.2軟件對等位基因進行判讀。對每對引物擴增產(chǎn)物的等位基因做頻數(shù)分布圖。結(jié)果見圖1～5。

圖1 引物1的基因頻數(shù)分布圖

圖2 引物2的基因頻數(shù)分布圖

圖3 引物3的基因頻數(shù)分布圖

圖4 引物4的基因頻數(shù)分布圖

圖5 引物5的基因頻數(shù)分布圖

由等位基因圖可看出，等位基因的擴增結(jié)果與瓊脂糖電泳的電泳結(jié)果無明顯差異，其片段大小均上下浮動在16bp 左右,表明這種方法準確可靠。中國林蛙長白山亞種與其它地區(qū)林蛙的等位基因片段大小頻次分布不一樣，基因片段大小差異比較大，有利于中國林蛙長白山亞種與其他種屬林蛙的區(qū)分。

4 討論

采用5種微衛(wèi)星引物對中國林蛙長白山亞種、黑龍江伊春林蛙、遼寧桓仁林蛙以及吉林四海林場林蛙進行PCR擴增和分析。由5對引物的PCR擴增結(jié)果可知，在瓊脂糖電泳圖中,每種引物均可以鑒別4種不同產(chǎn)區(qū)的林蛙。為使實驗結(jié)果更準確,采用熒光標記的方法進行等位基因擴增，進一步驗證了微衛(wèi)星鑒別方法的準確性和可靠性。

微衛(wèi)星PCR結(jié)果雖有差異，但5種引物的擴增片段大小差異并不大，實際應(yīng)用中可采用多種引物分別進行鑒別,綜合多引物擴增片段的結(jié)果來評價和鑒別。每個物種的不同引物PCR擴增片段的大小均不相同，增加引物進行研究可以提高鑒別的精準度，今后可考慮大量篩選微衛(wèi)星引物，增加選取樣品的品種和數(shù)量，篩選具有更高特異性的微衛(wèi)星引物[5-7]。

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