針刀對腰突根性神經(jīng)痛大鼠外周鎮(zhèn)痛機制的實驗研究

付偉濤,郭長青*,梁楚西,黃怡然,張麗萍,崔成俊,樸起范,孫紅梅,許 紅,郭 健,趙淑英

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

腰椎間盤突出癥(Lumbar Disc Hernation，簡稱LDH)，又稱“腰椎纖維環(huán)破裂癥”或“腰椎髓核脫出癥”。整脊學(xué)概括為“由于外力作用引起腰椎骨關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)、傾斜、錯位，導(dǎo)致椎間盤突出椎間孔或椎管，刺激到脊神經(jīng)或脊髓；或因骨關(guān)節(jié)錯位、椎間孔移位，導(dǎo)致神經(jīng)根位移與椎間盤產(chǎn)生卡壓，引起腰椎活動障礙、腰痛、下肢放射性疼痛，稱“腰椎間盤突出癥”。[1]腰椎間盤突出癥是常見病和多發(fā)病，對患者日常生活和工作造成嚴重影響。大量的臨床報道肯定了針刀治療腰椎間盤突出癥的療效[2-5]，但其作用機理仍處于假設(shè)和論證階段。本實驗通過觀察腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛大鼠血清中5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)、β-內(nèi)啡肽(β-endorphins，β-EP)含量的變化，探討針刀療法的外周鎮(zhèn)痛機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 清潔級SD雄性健康大鼠40只,體質(zhì)量(250±20) g。由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供(動物生產(chǎn)許可批號SCXK(京)2001-0001)，北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院針灸機理實驗室動物室喂養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為正常組、假模型組、模型組、針刀組，每組各10只。

1.2 主要儀器 HZ系列一次性使用針刀，規(guī)格0.4 mm×40 mm(漢章針刀,北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司)；骨科手術(shù)器械(手術(shù)刀、剪、鑷、鉗);9號腰椎穿刺針(揚州市江洲醫(yī)療器械有限公司)；低溫離心機(德國Eppendorf公司，5810R)MDF-U50A超低溫冰箱(日本SANYO公司)；AE-160電子天平(瑞士METTLER公司);勻漿器、96孔板、移液器、離心管、醫(yī)用縫合針、4號縫皮絲線；Thermo Multiskan MK3(產(chǎn)地：芬蘭)。

1.3 主要試劑 75%酒精(北京海德潤制藥有限公司)；碘伏消毒劑(武漢同濟美迪生科技有限公司);0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)；鹽酸利多卡因注射液(浙江泰康藥業(yè)集團有限公司)；水合氯醛(北京化學(xué)試劑廠)；大鼠5-HT、β-EP ELISA測定試劑盒(北京瑞格博科技有限公司)。

1.4 造模方法 運用陸志東[6]非壓迫性腰椎間盤髓核突出模型造模方法。自體髓核混懸液的制備：術(shù)前1 d，大鼠背部用脫毛劑脫毛。10%水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔麻醉，無菌條件下距尾根部1 cm處切下鼠尾并縫合傷口。切開尾部椎間盤，見髓核呈膠凍樣約10 mg，取5個髓核，按每1 mg加入1 μL生理鹽水配比，充分攪拌稀釋成混懸液備用。模型組：將大鼠腰椎置于屈曲側(cè)臥位，以L4～5棘突間隙為穿刺點，用9號腰椎穿刺針行硬膜外穿刺，成功后注射20 μL大鼠自體髓核混懸液，接著將2%利多卡因30 μL注射到硬膜外腔。假模型組：麻醉、斷尾、硬膜外穿刺同實驗組，不同的是將20 μL生理鹽水和2%利多卡因30 μL注射到硬膜外腔。針刀組造模方法同模型組。

水合氯醛麻醉恢復(fù)后，大鼠四肢活動自如，說明硬膜外穿刺和注射失敗。雙前肢活動自如，雙后肢運動、感覺喪失或減退，20～30 min后完全恢復(fù)，說明硬膜外穿刺注射成功。此時，可繼續(xù)進一步觀察其雙下肢有無癱瘓(步態(tài)不穩(wěn)或足外翻)以判定造模過程中是否對脊髓有損傷。若無癱瘓，則對其兩側(cè)后足進行熱刺激痛覺過敏的檢測，若熱痛反應(yīng)出現(xiàn)痛覺過敏，則提示造模成功。

1.5 處理方法 正常組正常飼養(yǎng)。假模型組：假造模后正常飼養(yǎng)。模型組造模后正常飼養(yǎng)。針刀組造模3 d后給予針刀干預(yù)。施針刀時首先用自制襪套將大鼠固定于鼠板上，以使其不能強烈掙扎為度。在L4～5棘間、L4～5棘間旁開0.1 cm處局部消毒,進行針刀操作，以大鼠下肢觸電樣抽動為度。每周治療1次，共治療1次。

1.6 取材 造模后第8天將各組大鼠分別固定于鍘刀,在枕骨大孔水平斷頭處死。各組大鼠均采用斷頭后迅速倒置，離心管收集全血5 mL，4 ℃下靜置3 h，置于離心機內(nèi)離心(參數(shù)：4 ℃，3 500 rpm，10 min)，離心后取上清，放于-20 ℃冰箱中保存待測。

1.7 觀察指標 1)行為學(xué):從造模第1天開始觀察記錄大鼠有無煩躁、撕咬肢體、頻繁的搖動尾巴、后肢或足突然自發(fā)抬起、用嘴反復(fù)舔后爪、食欲降低等。并與造模前后分別檢測大鼠的熱痛閾。2)后肢機械刺激縮爪閾值的變化：后肢機械刺激縮爪閾值的檢測均選擇在下午(13:00-18:00)，將各組大鼠放于PL-200型熱痛測試儀的檢測盒內(nèi)，輻射熱光源經(jīng)底部玻璃板聚焦到一側(cè)足底的后半部，光斑直徑5 mm。記錄從開始照射到產(chǎn)生縮爪的時間。每次測試間隔至少5 min，測量3次取平均值，兩側(cè)后足交替檢測，根據(jù)平均值求出兩后足熱刺激縮爪潛伏期，按公式：術(shù)前潛伏期—術(shù)后潛伏期進行計算，差值大于正常大鼠組差值則表明潛伏期降低，對熱痛反應(yīng)存在痛覺過敏。3)血清中細胞因子的檢測：采用雙抗夾心ELISA法檢測血清中5-羥色胺、β-內(nèi)啡肽，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。4)切片HE染色,顯微鏡觀察照相。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué) 大鼠造模后活動減少，精神萎靡，多蜷縮于籠中一角，飲食、飲水較正常減少。自由活動時，行走速度變慢，步幅和頻率減小，未出現(xiàn)撕咬肢體、頻繁搖動尾巴、后肢或足突然自發(fā)抬起、用嘴反復(fù)舔后爪、食欲降低，而出現(xiàn)了易激惹、活動頻繁的行為。

2.2 各組大鼠的熱痛刺激縮爪閾值 見表1。造模前后各組大鼠縮爪時間差值比較,采用One-Way ANOVA，F(xiàn)=22.631，P=0.000,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組與其他各組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

組 別造模前后縮爪時間差值正常組 0.63±0.35 假模型組0.72±0.50 模型組 2.70±0.64##△△針刀組 0.92±0.69▲▲

注：與正常組相比,##P<0.01；與假模型組相比,△△P<0.01;與模型組相比,▲▲P<0.01

2.3 針刀對腰突根性神經(jīng)痛大鼠血清中5-HT和β-EP含量的影響 見表2。各組大鼠血清中5-HT含量的比較，采用One-Way ANOVA，F(xiàn)=3.238,P=0.020，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。針刀組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);各組大鼠血清中β-EP含量的比較，采用One-Way ANOVA,F=3.696,P=0.011，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。針刀組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組大鼠血清中5-HT、β-EP含量比較

注：與正常組相比,#P<0.05，##P<0.01；與假模型組相比,△P<0.05;與模型組相比,▲▲P<0.01

2.4 光鏡觀察 正常組(a)、假模型組(b)：神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)致密、完整，有髓纖維的髓鞘完整、排列規(guī)則整齊，雪旺細胞大小均勻一致，數(shù)量較多，軸突表面規(guī)則完整，排列規(guī)則，無水腫；模型組(c):有髓纖維的髓鞘不完整，排列不規(guī)則，雪旺細胞數(shù)量減少，軸突邊緣模糊，大小不規(guī)則，出現(xiàn)水腫變形，排列稀疏，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的空泡；針刀組(d):與模型組相比，出現(xiàn)新生的髓鞘，髓鞘整體排列規(guī)則，大小基本一致，軸突無水腫，排列整齊，雪旺細胞大小一致。見圖1。

圖1 治療后各組大鼠右側(cè)L5神經(jīng)根光鏡觀察結(jié)果

3 討論

對于LDH的病因及發(fā)病機理,現(xiàn)階段較為公認的原因是由于多種椎間盤突出引起的機械性壓迫因素和(或)多種化學(xué)與免疫因素，包括多種化學(xué)性炎癥介質(zhì)、免疫性炎癥介質(zhì)及細胞因子(CK)及神經(jīng)源性炎癥介質(zhì)在該病的發(fā)生中起重要作用[7],突出的椎間盤組織壓迫神經(jīng)根或神經(jīng)根被牽伸是引起坐骨神經(jīng)痛的原因，但是也發(fā)現(xiàn)許多病人髓核和神經(jīng)根之間的接觸并沒有機械壓迫，也有明顯的腰腿痛，本實驗所建立的動物模型及實驗亦證實了這一點：將大鼠自體髓核移植到硬膜外腔，未出現(xiàn)運動障礙，排除了機械壓迫因素后，大鼠活動頻繁，易激惹，模型組大鼠造模前后熱刺激縮爪時間差值明顯高于正常組和假模型組(P<0.01,P<0.05),后肢出現(xiàn)明顯的痛覺過敏反應(yīng)，說明病理情況下髓核本身也能引起坐骨神經(jīng)痛。組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示有髓神經(jīng)纖維的脫髓鞘改變，空泡樣變性等病理改變，表明髓核本身的自身免疫炎癥反應(yīng)是引起根性神經(jīng)痛的可能因素之一。

5-羥色胺又叫血清素(serotonin),是色氨酸(Trp)的代謝產(chǎn)物，在人體中樞及外周組織中分布廣泛。在外周5-HT系統(tǒng)中，5-HT是一種有很強烈致痛作用的外周致痛物質(zhì)。當組織受損,血小板釋放5-HT,在局部炎癥中激活和敏化一些傷害性傳入纖維,在外周疼痛的發(fā)生中發(fā)揮作用[8]。本研究結(jié)果顯示，造模后模型組大鼠血清中5-HT的含量明顯升高(P<0.01)，表明造模后由于髓核的免疫炎癥反應(yīng)促使機體釋放5-HT等物質(zhì)，引起了機體的痛覺過敏和痛反應(yīng)。針刀干預(yù)后，血清中5-HT含量均較模型組顯著降低(P<0.01)，說明針刀干預(yù)后,可減少外周5-HT的釋放，減輕模型鼠的疼痛。這提示針刀療法能顯著改善腰椎間盤突出癥根性神經(jīng)痛的炎癥反應(yīng)，為臨床治療提供了實驗依據(jù)。

研究表明，免疫細胞在炎性痛局部區(qū)域釋放內(nèi)源性阿片肽，它們與位于軀體感覺初級傳入神經(jīng)元的外周突及其末梢上的阿片受體結(jié)合，抑制神經(jīng)元的興奮性和興奮性神經(jīng)活性物質(zhì)的釋放，導(dǎo)致局部鎮(zhèn)痛。各種內(nèi)源性阿片肽都有鎮(zhèn)痛作用，但作用性質(zhì)不同。從內(nèi)源性阿片肽的分類來看,β-EP有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[9]。其鎮(zhèn)痛作用比嗎啡強數(shù)十倍維持1 h以上，而腦啡肽的鎮(zhèn)痛卻遠弱于嗎啡，作用維持還不到10 min[10]。本實驗結(jié)果顯示，造模后，模型組大鼠血清中β-EP的含量較正常組顯著升高(P<0.01),針刀組干預(yù)后，血清中β-EP含量均較模型組顯著降低(P<0.05)，說明針刀干預(yù)后,可減少外周β-EP的釋放，減輕模型鼠的疼痛。提示局部炎癥本身可啟動外周內(nèi)源性阿片肽的釋放，針刀療法可通過調(diào)節(jié)外周β-EP的釋放而起到鎮(zhèn)痛作用。

針刀療法是將針刺療法和手術(shù)松解法有機地結(jié)合為一體，一方面利用針的作用，疏通氣血、活血化瘀，“通則不痛”；另一方面利用刀的切割作用，松解黏連，解除卡壓，“以松致通，通則不痛”。本實驗證實，針刀療法可直接作用于腰椎間盤突出癥病變局部，松解局部的黏連和攣縮，改善局部循環(huán)，減輕炎癥反應(yīng),并調(diào)節(jié)血清中5-HT和β-EP的含量而起到鎮(zhèn)痛作用。

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